htertmrna在涎腺多形性腺瘤中的表达分析-expression of htertmrna in pleomorphic adenoma of salivary gland.docx

列腺癌、98%的膀胱癌、95%的大肠癌和宫颈癌[14]都存在端粒酶活性的高表达[15]。许多学者认为：hTERT的激活是恶性肿瘤发生的一个共同途径。hTERT目前可以做为各种恶性肿瘤细胞共同的分子标志物，也可以做为恶性肿瘤预测预后的标志,并被认为是目前为止最具有特异性和敏感性的人类肿瘤分子标记物[16,17]，而hTERT在涎腺肿瘤中的表达研究较少。原位杂交（insituhybridization,ISH）是一种结合了细胞技术与核酸杂交技术的新型核酸分析检测技术，即利用分子杂交技术对基因在染色体上定位。由于hTERTmRNA表达水平与端粒酶活性水平呈正相关性，因此通常通过合成与其相配对的带生物标记的人工探针与hTERTmRNA作原位杂交来检测端粒酶活性[18]。在恶性肿瘤中端粒酶活性高表达的报道已经很多，而在涎腺多形性腺瘤中的相关研究相对较少。色素原位杂交（Chromogenicinsituhybridization,CISH）技术。在实验操作技术和程序上与免疫组化类似，可以检测hTERTmRNA在涎腺多形性腺瘤中的表达及分布情况。实验试图通过hTERTmRNA在涎腺多形性腺瘤中的表达及特点，讨论涎腺多形性腺瘤良、恶性的临床意义，同时为多形性腺瘤的临床治疗、评价愈后、制订相应的治疗方案提供可靠依据。材料与方法1.1研究标本研究标本分别来自贵阳医学院附属医院口腔颌面外科、贵州省人民医院口腔颌面外科、遵义医学院附属口腔医院颌面外科。选择2011年7月至2012年1月临床及病理证实，未经任何治疗的涎腺多形性腺瘤组织标本30例，年龄在15~64岁之间，平均年龄36.8岁，男性13例；女性17例。口腔鳞癌（OSCC）患者肿瘤组织标本8例。门诊粘液腺囊肿术中摘除的唇腺及涎腺包块手术中瘤体周围1cm以外的正常涎腺组织标本6例，OSCC、正常组在性别，年龄上与PA匹配，具有可比性。以上标本均经4%多聚甲醛（含DEPC）溶液固定、在DEPC保护下常规石蜡包埋、HE染色及严格的病理切片复查。切片制备时在DEPC保护下以每例标本作4μm连续切片5张，裱于APES剂处理的防脱载玻片上，切片置于65℃烤箱中烘烤2小时。制作1张HE染色片由病理医师盲法，重新核实组织病理学诊断，同时对涎腺多形性腺瘤（PA）组织进行肿瘤分型：根据低倍镜下视野内上皮细胞和基质所占比例将PA标本分为细胞丰富型和间质丰富型。另4张分别作TERTmRNA的色素原位杂交检测。按原位杂交检测试剂盒说明书，同时设立对照组：以试验证实TERTmRNA表达阳性的鳞状细胞癌组织切片为阳性对照、以正常涎腺组织切片为阴性对照、以PBS缓冲液为探针作空白对照，四组同时完成。由于细胞外周及自然界中存在大量RNA酶，hTERTmRNA会在RNA酶的作用下迅速降解，导致试验中本该高表达的阳性组织切片区因降解hTERTmRNA而低表达或不表达。因此试验中应严格在超净工作台中进行无酶操作，尽量避免RNA酶对hTERTmRNA的降解，提高阳性率、降低实验误差[19]。1.2实验试剂及仪器实验试剂：hTERTmRNA原位杂交检测试剂盒（MK1158h武汉博士德）、二胺基联苯胺显色试剂盒（DABAR1022武汉博士德）、原位杂交专用PBS缓冲液(ISH-PBSAR0033武汉博士德)、焦炭酸二乙酯（DEPC，AmrescoE174）。实验仪器：电热恒温鼓风干燥箱（101-1，上海跃进）；超净工作台(SW-CJ-2FD型苏州净化)；水浴箱（S-HH-W21-420S型上海跃进）；恒温培养箱（DH-4000B型天津泰斯特）；图象分析系统（Biomias2001四川大学图像图形研究所）1.3色素法原位杂交（CISH）（具体步骤）：(1)、配制DEPC水（ddH2O∶DEPC＝1∶1000）浸泡试验器具；用DEPC处理水（DEPC水经高温高压125℃、25min）制备梯度酒精和梯度SSC溶液。(2)、试验器具均经75%酒精消毒、DEPC水浸泡4小时（或经擦拭），以除掉RNA酶。可耐受高温高压者应予浸泡后高温高压消毒后锡纸包裹，防止RNA酶污染。不可高温高压者应待自然晾干后锡纸包裹备用。试验操作全程在超净工作台中完成，应严防汗液及气溶胶等富RNA酶介质污染。(3)、石蜡切片水平置于55℃烤箱内过夜。实验前所有用具均经紫外线消毒30分钟。(4)、脱蜡至水：二甲苯（2缸，20min/缸）→梯度酒精3min/缸（100%—95%—90%—75%）→DEPC处理水冲洗。（梯度酒精用DEPC水配制）(5)、用DEPC处理水配置新鲜的3%双氧水（9份DEPC处理水加1份30%H2O2），室温10min，用以阻断内源性过氧化物酶，DEPC处理水冲洗3次。(6)、暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶（1ml3%柠檬酸加2