il10修饰的内皮祖细胞对非增生期糖尿病视网膜病变发展的影响和分子机制的研究-effects and molecular mechanism of il - 10 modified endothelial progenitor cells on the development of non-proliferative diabetic retinopathy.docx

学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有 关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。本论文属于保密，在年解密后适用本授权书。不保密。（请在相对应的方框内打“√” ）学位论文作者签名：日期：年月日 导师签名 ：日期：年月日目录中文摘要 IIIAbstract VIIII缩略语/符号说明 X前言 1一、过表达 IL10 对大鼠骨髓起源的 EPCs 生物学特征的影响51.1.对象和方法 51.1.1 对象 51.1.2 方法 91.1.3 统计学方法 201.2 结果 211.2.1 大鼠骨髓来源 EPCs 的分离、培养及鉴定211.2.2 慢病毒感染内皮祖细胞 221.2.3 各组细胞生物学特性实验结果 231.2.4 培养基 TNF-α, IL-10, IL-8 和 VEGF 的浓度271.2.5 各组细胞中 Western Blot 检测结果281.3 讨论 291.4 小结 34 二、过表达 IL10 的 EPCs 对大鼠 DR 病情的影响 35 2.1 对象和方法 352.1.1 对象 352.1.2 方法 382.1.3 统计学方法 432.2 结果 432.2.1 糖尿病动物模型的建立 432.2.2 各组大鼠体质量及血糖情况 432.2.3 视网膜免疫组化 GFP 检测结果442.2.4 视网膜组织病理学检查 HE 染色结果442.2.5 视网膜电镜检测结果 45I2.2.6 伊文思蓝血管灌注荧光造影视网膜铺片 472.2.7 视网膜伊文思蓝渗漏量测定 482.3 讨论 492. 4 小结 53 三、过表达 IL10 的 EPCs 治疗 DR 大鼠分子机制的作用 54 3.1 对象和方法 543.1.1 对象 543.1.2 方法 583.1.3统计学方法 643.2 结果 643.2.1 视网膜 RT-PCR 定量检测结果 653.2.2 视网膜 Western Blot 检测结果 653.3 讨论 683.4 小结 71全文结论 72论文创新点 73参考文献 74发表论文和参加科研情况说明 81综述 82致谢 92II中文摘要目的：本研究通过建立过表达 IL-10 的 EPCs，明确 IL-10 对 EPCs 生物学特征的 影响；研究 IL-10 修饰的 EPCs 对非增生期糖尿病视网膜病变病情的影响，并探 讨其作用途径。方法：（1）采用密度梯度离心法提取出生后 7 天～9 天的雄性 Wistar 大鼠骨髓中 的单个核细胞，将其接种培养于预先使用纤维连接蛋白包被的培养板中；培养 7 天后，利用 Dil 标记的乙酰低密度脂蛋白（Dil-acLDL）和 FITC 标记的荆豆凝集 素（FITC-UEA-I）双标免疫荧光细胞化学染色法，以及 FITC 标记的血管性血友 病因子（FITC-vWF）、PE 标记的血管内皮生长因子受体 2（PE-VEGFR2）免疫 荧 光 细 胞 化 学 染 色 法 鉴 定 EPCs 。 并 将 慢 病 毒 包 装 的 IL-10 质粒 （EPC-LV-IL-10-GFP）或空白质粒感染 EPCs（EPC-LV-NC-GFP），感染 48～72 小时后荧光显微镜下观察感染效率，并采用流式细胞仪、Transwell 法、成管能 力和粘附能力实验检测观察各组细胞的细胞周期、迁移、成管和粘附功能。采 用酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）测量各组 细胞培养基中多种炎性因子的表达量。采用蛋白质印迹法（Western Blot）测定 各组细胞 中信号 转导 和转录激 活因子 3 ( signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)信号通路中相关因子表达的变化。（2）雄性成年 Wistar 大 鼠 240 只，随机分为正常对照组（40 只）和实验组（200 只）。实验组采用腹腔 一次性注射链脲佐菌素建立糖尿病视网膜病变模型，造模成功后 3 个月时，实 验组大鼠随机分为糖