《园艺植物生物技术知识》第二节 基因克隆操作.ppt

第二节 基因克隆操作;一、基因分离的意义;2. 基因分离的工具;1973年Cohen完成第一个基因操作实验;二、基因分离常用工具;②连接酶 体外催化磷酸二酯键的形成可使用两种酶：大肠杆菌连接酶和T4噬菌体连接酶，但几乎在所有的克隆中T4噬菌体连接酶都是首选的酶，因其能在正常的反应条件下能有效的将平端连接起来。 ;各种连接酶特性的比较：;③聚合酶;载体必备条件： 含有复制子，载体在受体细胞中能大量繁殖，其携带的外源基因才能在受体细胞中得到大量扩增； 有1到几个限制内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入； 具有选择性的遗传标记(如抗生素抗性标记等)以此知道它是否已进入受体细胞，并据此标记将受体细胞从其他细胞中分离出来。;载体类型;质粒是染色体之外的一种稳定的遗传因子，具有自主复制和转录能力 是双链闭合环状DNA分子 大小在1－20kb之间 它可独立游离于细胞质中，也可整合到细菌染色体上。;质 粒;pCAMBIA1301和pCAMBIA1391的区别？;标记基因;质粒 转录载体;插入型载体;噬菌体载体：置换型载体;噬菌体或病毒DNA;噬菌体载体;粘粒载体 Cosmid;BAC/YAC载体;⑤受体细胞 1、定义：外源DNA导入的细胞，是重组体扩增的场所。 2、要求：易于接纳外源DNA 无特异的内源性核酸内切酶 载体复制、扩增不受阻 与载体有互补性 3、细胞生长过程中有这样的时期。;受体类型;DNA向宿主细胞的导入方法;三、聚合酶链式反应（ PCR ）;PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；? ②退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；? ③延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。? 重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2???4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。;标准的PCR反应体系 ? 10×扩增缓冲液 　 ? 10 ul ? 4种dNTP混合物 　 各200 umol/L 引物 　　　　 　 ? ? 各10～100 pmol 模板DNA 　　　 　0.1～2 ug Taq DNA聚合酶 　 ?2.5 u Mg2+　　　　　　 1.5 mmol/L 加双蒸水至 　 ?100 ul ;四、基因文库;基因文库;cDNA 文库;文库构建的基本过程;目的基因(target DNA)的制备;DNA的体外连接（DNA连接酶） 粘性末端连接 连接效率高 相同酶切末端 TA cloning 平端连接 连接效率低 人工接头(linker)法 同聚物接尾法;将外源DNA导入宿主细胞;五、目的基因的筛选和鉴定(screening/selection);?互补(?-complementation): 许多常用载体（pUC系列）都带有一个大肠杆菌DNA的短片段，其中含有?-半乳糖苷酶（LacZ）的调控序列和头146个氨基酸的编码序列，该编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏阅读框，不影响功能。这种载体适用于可编码?-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。 虽然宿主和质粒编码的片段都没有活性，但它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质。这样，LacZ基因缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的?-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补，这种现象叫?互补。;x-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-?-D-半乳糖苷) 生色剂;由?互补而产生的LacZ＋细菌易于识别，因为它们在生色底物x-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-?-D-半乳糖苷)存在下，形成蓝色菌落，而外源片段插入到质粒的多克隆位点以后几乎不可避免地导致产生无?互补能力的氨基端片段，因此，带重组质粒的细菌形成白色菌落。 IPTG（异丙基硫代-?-半乳糖苷）：是?-半乳糖苷酶活性的诱导物，也可作为具有Lac或Tac启动子的表达载体的表达诱导物来使用。;IPTG; X-gal(5- 溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷);蓝白斑筛选常用于PCR产物克隆;T/A Cloning;蓝白斑筛选;基因的鉴定; bp —1534 — 994 — 695 — 515 — 377 — 237;邹昌勇 等 2006;测 序;