利用rnai技术研究拟南芥ca2泵基因eca1和aca2的功能-study on the function of ca 2 pump genes eca 1 and aca 2 in arabidopsis thaliana by rnai technology.docxVIP

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2018-05-29 发布于上海
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利用rnai技术研究拟南芥ca2泵基因eca1和aca2的功能-study on the function of ca 2 pump genes eca 1 and aca 2 in arabidopsis thaliana by rnai technology.docx

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利用rnai技术研究拟南芥ca2泵基因eca1和aca2的功能-study on the function of ca 2 pump genes eca 1 and aca 2 in arabidopsis thaliana by rnai technology

摘要钙离子(Ca2+)对植物的生长发育是至关重要的，植物细胞中的Ca2+浓度是受严格控制的，植物对细胞内Ca”浓度的调节依赖于定位在不同细胞器和质膜上的Ca2+通道(Calcium channel)、Ca2+泵(Calcium pump)和反转运子 (Calcium proton antiporter)的活性。迄今为止，植物中已有数种Ca2+泵被发现，分两种类型：内质网型(ER．type Calcium ATPase(ECAs))和自我抑制型(Autoinhibted Calcium ATPase(ACAs)Ca2+泵。本试验采用RNAi技术研究定位于拟南芥(Arabidopsis thaliana)内质网上的钙泵ECAl和ACA2 功能。主要结果如下：1．针对钙泵基因EC4J和ACA2，分别设计引物PCR扩增得到特异片段，用此片段构建成RNAi载体：pGreen0029一ECAl-1一Sense—GFP—ECAl．1一Antisense(E1一G-E1)： pGreen0029-ACA2．I—Sense—GFP—ACA2．I—Antisense(A2一G—A2)。2．载体经酶切验证正确后，采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 花粉浸蘸的方法介导转化拟南芥。抗生素筛选及PCR检测证明得到转基因植株。对转基因植株后代进行卡那霉素抗性筛选等遗传分析，获得了T3代纯合体转基因植株(其中转E卜G—E1的11个株系，转A2一G．A2的12个株系)。3．对这些转基因株系进行RT．PCR分析，转E1．G．E1的11个株系中， E谢J的转录产物比野生型(Wt)有明显降低，且转基因株系之间差异明显，表达水平有一个梯度关系：转A2．G—A2的12个株系中，ACA2的转录产物比野生型(Wt)有明显降低(A2—11除外)，且转基因株系之间差异明显。 4．在l／2MS培养基上转E1．G．E1和A2一G．A2的转基因株系与野生型均无明显区别。在低Ca2+(0．2 mmol-L。1)或高Mn2+(O．5 mmol·L‘1)的培养基上，转E1．G—E1基因株系与野生型相比，生长受到不同程度的抑制，EC■，转录量越低，生长受到抑制越大；在低Ca2+(O．2 mmol·L。1)或高Mn”(0．5 mmol·L‘1)的培养基上，转A2．G．A2基因株系与野生型相比无明显区别。关键词：Ca2+泵；内质网型Ca2+泵；自我抑制型Ca2+泵；RNA干扰Analysis of ECA l and A CA2 Function by RNA Interference in Arabidopsis thaliana^bst ractThe spatial and temporal regulation of calcium concentration in plant cells depends on the coordinate activities of channels and active transporters loc ated on different organelles and membranes．Until now，several Ca2+pumps have beenidentified in plant，which fall into two major types：ER—type Calcium ATPase(ECAs)and Autoinhibted Calcium ATPase(ACAs)．Here，we analysed the function ofECAl and ACA2 by RNA interference in Arabidopsis thaliana．The results showed as followering：1．The RNAi vector containing ECAl and ACA2 gene—specific sequences in the sense and antisense orientations was constructed：pGreen0029一ECAl．I．Sense．GFP—ECAl．I-Antisense(E1-G·E1)： pGreen0029一ACA2．1一Sense．GFP—ACA2—1-Antisense(A2一G-A2)．2．After confirmed by enzyme digestion，two constructs were transformedinto Arabidopsis thaliana plant by Agrobacterium tumefaciens—mediated transformation