抗ω-抗w.docxVIP

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抗ω-抗w

独创性声明本人声明,所呈交的学位(毕业)论文,是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果,并且是自己撰写的。尽我所知,除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外,论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志,都在论文中作了明确的说明并表示了谢意,如被查有侵犯 他人知识产权的行为,由本人承担应有的责任。学位(毕业)论文作者亲笔签名:日期:论文使用授权的说明本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位(毕业)论文的规定,即学 校有权送交论文的复印件,允许论文被查阅和借阅; 学校可以公布论文的全部或 部分内容,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。保密,在年后解密可适用本授权书。□ 不保密,本论文属于不保密。□学位(毕业)论文作者亲笔签名:日期: 指导教师亲笔签名:日期:目录摘 要IAbstract II第一章 文献综述 11.1 芋螺毒素研究概况 11.1.1 芋螺的生物学特征 11.1.2 芋螺毒素的结构和分类 31.1.3 芋螺多肽的命名 31.1.4 芋螺毒素作用机理 41.1.5 ω-芋螺毒素研究概况61.1.6 芋螺毒素的检测方法 91.2 单克隆抗体技术 91.2.1 单克隆抗体技术历史背景 91.2.2 杂交瘤技术基本原理 101.2.3 单克隆抗体的大量制备 11第二章抗 ω-芋螺毒素 MⅦA 单克隆抗体的制备142.1 实验材料与方法 142.1.1 实验材料 142.1.2 实验方法 152.2 实验结果 252.2.1 完全抗原的制备 252.2.2 小鼠血清效价的测定 262.2.3 小鼠血清特异性 282.2.4 筛选体系的建立 282.2.5 骨髓瘤细胞的制备 292.2.6 饲养细胞的制备 302.2.7 脾细胞的制备 302.2.8 细胞融合 312.2.9 杂交瘤细胞筛选结果 322.3 讨论 322.3.1 抗原制备 322.3.2 细胞融合注意事项 332.3.3 杂交瘤筛选注意事项 332.4 小结 34 第三章 抗 ω-芋螺毒素 MⅦA 单克隆抗体的鉴定 35 3.1 实验材料与方法 353.1.1 实验材料 353.1.2 实验方法 363.2 结果 403.2.1 单克隆抗体亚类鉴定 403.2.2 杂交瘤细胞培养上清效价测定 413.2.3 腹水效价的测定 423.2.4 杂交瘤细胞株稳定性测定 423.2.5 细胞染色体分析 433.2.6 单克隆抗体纯化 443.2.7 单抗相对分子质量测定 443.2.8 腹水纯化前后蛋白浓度测定 453.2.9 腹水纯化前后效价测定 463.2.10 抗体亲和力测定 473.2.11 单抗特异性测定 483.3 讨论 493.3.1 单克隆抗体类和亚类 493.3.2 抗体纯化 493.3.3 单克隆抗体稳定性 503.3.4 抗体亲和力 513.4 小结 52参考文献 53致谢 58附录 59摘 要芋螺毒素(Conotoxin,CTX)是芋螺(Cone snails)分泌的用于捕食和防御 的一种具有生物活性的小分子多肽类神经毒素,一般含有 10~30 个氨基酸,大多 富含二硫键,靶定神经系统的离子通道和受体,人和动物被叮咬后一般会出现麻 痹、抽搐、惊厥甚至死亡。ω-芋螺毒素 MⅦA (ω-CTX MⅦA)含有 25 个氨基酸残 基,是特异的和可逆的 N-型电压敏感性钙离子通道的阻断剂,可当做镇痛剂治 疗剧烈的和慢性的疼痛。目前还没有基于单克隆抗体的 ω-CTX MⅦA 的免疫检 测方法。本研究制备了抗 ω-CTX MⅦA 的单克隆抗体,为建立 ω-CTX MⅦA 的 免疫检测方法奠定了基础,在神经系统的钙离子通道研究中也具有潜在的应用价 值。在本研究中,GST-CTX 融合蛋白作为免疫抗原免疫 BALB/c 小鼠,Trx-CTX 融合蛋白作为检测抗原包被酶标板,检测和筛选抗 ω-CTX MⅦA 的抗体。当抗 血清效价较高时取小鼠脾细胞与 SP2/0 骨髓瘤细胞融合,制备杂交瘤细胞。两次 细胞融合实验的融合率分别为 99.27%和 100%,阳性率分别为 2.52%和 5.03%。 用有限稀释法对筛选到的阳性孔进行克隆化,得到了 6 株阳性杂交瘤细胞株,分 别命名为 9E4、7G10-D9、7G10-C7、4A12、5H10 和 5G2。对筛选到的 6 株阳性杂交瘤细胞株进行效价和稳定性检测,最后得到了一株 稳定分泌 ω-CTX MⅦA 单克隆抗体的杂交瘤细胞株,即 4A12。该杂交瘤细胞有 102±2 条染色体,分泌 IgM 类单克隆抗体。制备的腹水效价可达到 1:128000, 抗体亲和力为 1.26×

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