壳聚糖载体在酶法测定和亲和层析中的应用分析-application and analysis of chitosan carrier in enzyme assay and affinity chromatography.docxVIP

的收率，提高产物的质量；酶的使用效率提高，成本降低[35]。1.2.1酶的固定化方法酶固定化的传统方法大致可分为：表面担载法、交联法和包埋法。表面担载法是通过物理或化学过程，将酶担载到非水溶性载体上。用这种方法制备固定化酶时，必须按酶的种类和性质选择合适的载体和固载方法(根据结合形式不同，担载法又可分为共价结合法、离子结合法及物理吸附法)。交联法是采用双功能团试剂或多功能团试剂进行酶分子之间的交联，使酶分子和双功能团试剂或多功能团试剂之间形成共价键，得到三维的交联网状结构。此法的优点是酶之间连接牢固，具有良好的稳定性及重复使用性，缺点是有时难以很好地控制反应条件，反应剧烈时，常常引起酶蛋白的高级结构发生变化，并导致活性中心受到破坏，从而难以保证每次都能得到高活力的样品[36]。包埋法是用一定方法将酶包埋于半透性的载体之中，制成固定化酶。该载体的孔径只允许小分子的底物、产物自由穿过，不允许大分子的酶穿过，从而使酶易于与产物分离。这是一种不需要化学修饰酶蛋白的氨基酸残基，反应条件温和，很少改变酶结构的固定化方法[37]。Bahar等[38]用磁性聚粒子固定葡萄淀粉酶，研究了最适pH为4，最佳温度为20~30℃，固定化酶效率达到70%。朱如瑾等[39]用等离子体活化处理聚丙烯膜接枝丙烯酸后可用于固定化胰蛋白酶。Monier等[40]对壳聚糖微球通过接枝聚丙烯酸乙酯进行改性，找到了一种在改性后的壳聚糖微球上实现辣根过氧化物酶的固定化的新方法，固定化效率达到98.4%，并研究了其酶学性质，结果表明固定化辣根过氧化物酶的热稳定性和贮存稳定性比游离酶都提高了。Mohy等[41]通过γ-射线引发将异丁烯酸甲酯接枝共聚于尼龙膜表面，经进一步活化，用于青霉素酰化酶的固定。1.2.2固定化酶的应用目前已能制备多种高活性和高稳定性的固定化酶，随着应用范围的不断扩大，固定化酶已在常用的固体催化剂中占有重要地位。对固定化酶反应机理及工艺与工程的研究，已引起酶化学与工程以及催化反应与工程领域科技工作者极大兴趣。和传统多相催化过程相比，在催化反应工艺中采用固定化酶，可以使反应在常温常压下进行，从而节省投资和能量消耗，并使反应流程得到简化[36]。固定化酶已广泛应用于各领域[42-44]。固定化酶可用于物质的分析检测，酶法测定就是用酶进行物质分析的一种方法，是以酶的专一性为基础、以酶作用后物质的变化为依据来进行的[35,45-46]。Bhushan等[47]用大孔共聚物的合成珠固定化脂肪酶，用来研究手性药物中间体的动力学拆分，结果表明此固定化酶脂肪酶对产品具有高对映选择性、高转化率以及使产品快速恢复等特点。Capio等[48]提出将固定化β-半乳糖苷酶和淀粉葡萄糖苷酶用于食品工业中。过程简单、易操作、成本低。Monzo[49]等利用液质联用技术，将固定化蛋白酶用于分析蛋白质的水解过程。结果表明此固定化酶可以使水解反应更快速有效且能减少自溶。马秀玲等[50]对磁性固定化酶处理含酚废水的研究表明:对于酚浓度为100mg/L的废水，磁性壳聚糖微球固定化辣根过氧化物酶对酚的去除率为92.8%。1.3亲和层析法概述亲和层析(affinitychromatography,AC)是蛋白质纯化的一种重要方法，具有很高的选择和分离性能以及较大的载量。只需要一步处理即可使某种待分离的蛋白质从复杂的混合物中分离出来，达到千倍以上的纯化，并保持较高的活性。20世纪60年代以前就有人应用此法，但由于固相载体的缺乏，使之发展缓慢。1967年Axen等发现了用溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋白质的方法，并成功的制备了固定化酶。这一固定化方法便在亲和层析中得到采用，从而解决了固相载体的制备问题，使酶类等大分子物质的纯化过程变得迅速和高效[27]。亲和层析的原理可用一个亲和对来说明。如生物大分子抗体可以与其对应的抗原发生亲和作用，若把抗原固定在类似于凝胶的固相载体上得到亲和固定相，在进行层析分离时，抗体与抗原间发生特异性的亲和作用，而其它物质不能与固定相结合，因而被洗脱出。然后用一种特殊的洗脱剂把抗体从亲和柱上洗脱下来，也可以固相抗体来提纯分离抗原[51]。目前亲和层析技术广泛应用在蛋白质研究和制备领域，是分离纯化以及分析生物大分子的有力工具。Zou等[52]提出了用膜亲和层析法分析和纯化蛋白质，与需装柱的传统亲和层析法相比，它有诸多优点，特别是在时间和酶活力回收方面。他们还提出用纤维素/缩水甘油基和异丁烯酸盐结合制成的复合膜可用于实验室的蛋白质分离纯化。Zhao等[53]利用一种新的纤维素作为亲和层析固定相基质，用亲和层析法纯化人体血浆内的抗凝血酶，它可达到93%的纯化率，蛋白质的收得率为90%。Ouyang等[54]以活性染料为配基，用亲和层析法分离碱性的磷酸酯酶和葡糖淀粉酶，它为分离纯化细胞