力生长因子e肽mgfct24e与应力作用对成骨细胞基因表达影响的基因芯片分析-gene chip analysis of the effect of stress on gene expression in osteoblasts by force growth factor e peptide mgf ct24 e.docxVIP

摘要最近力生长因子（Mechano growth factor, MGF）是生物力学及生长因子研究 方面的新热点。MGF 是 Igf-1 基因的选择性剪接变异体，在拉伸刺激的骨骼肌和损 伤的神经、肌肉等组织中高表达。进一步研究发现，MGF 及其 E 肽（MGF-Ct24E） 能够促进肌肉肥大，损伤修复，并且具有神经保护和心肌保护等功能。本实验室 的研究发现在拉伸刺激的成骨细胞中也有 MGF mRNA 的高表达，提示 MGF 也可 能是骨组织中响应力信号的效应因子，还发现 MGF 能够调控成骨细胞的增殖分化 过程，促进骨缺损修复作用。应力在骨组织的生长、重建过程中发挥了重要的调 控作用，骨折损伤部位往往因为缺乏应力而导致愈合后的骨质疏松甚至再骨折现 象。因此，本课题比较分析应力与 MGF-Ct24E 作用后成骨细胞的基因表达谱，寻 找两者在骨代谢调控方面的异同，设想以 MGF 代替应力解决骨损伤修复过程因固 定医疗措施使得应力严重降低的问题。主要内容和结论如下：（1）运用组织块培养法培养出新生大鼠颅骨成骨细胞，利用差时黏附法对培 养出的细胞进行纯化。通过形态学观察、碱性磷酸酶（ALP）染色、基质前体染色、 矿化结节染色等鉴定方法证实该组织块法培养的细胞具有典型的成骨细胞生物学 特征，符合后续实验要求。将传代培养至第三代的成骨细胞用于后续实验研究。（2）对细胞施加 12%的周期性拉伸刺激和 50ng/mL MGF-Ct24E 直接作用 8h， 以静态培养的细胞作为对照组，提取细胞总 RNA，进行基因芯片杂交实验分析各 组细胞的差异表达基因。以对照组为参照，在力学加载组的细胞中共发现差异表 达基因 1866 条，其中上调 1113 条，下调 753 条；在 MGF-Ct24E 处理组的细胞中共发现差异表达基因 1178 条，其中上调基因 796 条，下调基因 382 条。以力学加 载组为参照，分析 MGF-Ct24E 处理组的细胞发现差异表达基因共 602 条，其中上 调基因 290 条，下调基因 312 条。（3）应用 Gene Ontology(GO)数据库对筛选出的差异表达基因进行基因本体 论分析，分类分析各差异表达基因的功能类型。应力和 MGF-Ct24E 作用成骨细胞 后，得到的差异表达基因所参与调控的 GO 类型有众多相似之处。这些共同之处 主要是关于细胞增殖和分化、细胞周期、骨发育和骨化的调节，细胞迁移及对应 力刺激的响应等。除了两者共同调节的表达类型外，应力作用后的差异表达基因 还参与调控了肌动蛋白细胞骨架组织、细胞生长、蛋白区域特异性结合和蛋白质 二聚化活性等；MGF-Ct24E 作用后的差异表达基因还参与调控了软骨发育、细胞 骨架、生长因子结合、蛋白激酶结合和受体结合等。以力学加载组为参照，分析MGF-Ct24E 处理组的基因表达谱，发现 MGF-Ct24E 处理组中的差异表达基因主要与胚胎和组织发育、转录与基因表达的正调节等有关。MGF-Ct24E 处理组与力学 加载组的差异表达基因在调控骨代谢方面有很高的相似性, 其差异基因表达的变 化趋势与差异表达倍数也基本一致。（4）通过细胞增殖、细胞周期分析和细胞分化检测等实验进一步 分析了 MGF-Ct24E 对成骨细胞生物学活性的影响。结果显示：MGF-Ct24E 在成骨细胞生 长早期促进了细胞的增殖，抑制了 ALP 活性；细胞周期分析发现 MGF-Ct24E 作 用组在第一天和第三天 S 期的细胞所占比例显著高于对照组，细胞增殖指数显著 提高，随着培养时间的延长增殖速度逐渐减缓，促增殖效率逐渐降低；在细胞分 化晚期，MGF-Ct24E 促进了胶原的表达和矿化结节的形成，促进了成骨细胞的分 化。说明 MGF-Ct24E 并非是抑制成骨细胞的分化，而是促进成骨细胞早期的增殖 活性，延迟了其分化活性。细胞实验所得结果与基因芯片分析结果一致。综上所述，MGF-Ct24E 和应力作用在骨代谢基因表达的调控方面有着极为类 似的效应，细胞实验分析再一次证实了 MGF-Ct24E 促进成骨细胞的增殖，延迟其 分化，最终促进骨形成作用。因此，MGF-Ct24E 有望能代替应力刺激用于骨损伤 修复的临床治疗。关键词：成骨细胞，力生长因子，基因芯片，增殖，分化ABSTRACTMechano growth factor (MGF) is a hotspot in the research fields of the biomechanics and growth factor recently. It is an alternative splicing variant of Igf-1 gene which is mainly expressed in stretched skelet