利用基因编辑技术talen建立k562细胞系flt3itd敲入模型-establishment of flt 3 it d knock-in model of k562 cell line by gene editing technology talen.docxVIP

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2018-05-29 发布于上海
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利用基因编辑技术talen建立k562细胞系flt3itd敲入模型-establishment of flt 3 it d knock-in model of k562 cell line by gene editing technology talen.docx

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利用基因编辑技术talen建立k562细胞系flt3itd敲入模型-establishment of flt 3 it d knock-in model of k562 cell line by gene editing technology talen

华中科技大学博士学位华中科技大学博士学位论文 PAGE 10 PAGE 10 第一部分基因编辑技术 TALEN 的构建及其突变筛选体系的优化和比较【摘要】类转录激活因子效应物核酸酶 (Transcription activator- like effector nuclease, TALEN)是人工构建的序列特异性核酸内切酶的一种，它能够识别并切割特定的 DNA 靶序列, 造成双链断裂, 并引起基因组结构的定点改变。它 2010 年底成功应用于基因打靶, 很快成为一种比锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease, ZFN)更容易设计、特异性更高和毒性更低的人工核酸内切酶。本文将用举例的方法从 TALEN 的设计、构建及六种活性或突变效率检测方法来建立并完善 TALEN 平台，并从方法的难易程度及优缺点进行评估六种突变率检测方法和合适的应用范围。通过 UA (Unit Assembly, 单元组装) 和 Golden Gate Vector based Assembly 方法合成 TALEN 质粒，并比较酶切， SSA 检测系统， T7E1 酶切加毛细血管电泳检测，加药 T 在检测以及单克隆检测等方法，比较构建及筛选的优缺点。我们成功构建了 TANLEN 质粒，并建立了较多的检测 TALEN 切割效果的方法，比较了各种方法的优缺点，找到合适的评估体系。我们推荐 T7E1 酶切试验作为早期筛选，选择最佳的 TALEN 质粒；切割双荧光报告系统可以作为后期单克隆筛选的重要的富集系统。【关键词】：类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)；基因组编辑；突变效率检测方法 Construction of the TALEN Gene editing technology and comparison of its mutation screening systems Abstract Artificial designer nucleases targeting specific DNA sequences open up a new field for reverse genetics study. The construction of transcription activator-like effector nucleases (TALENs) is simpler with higher specificity and less toxicity than zinc- finger nucleases (ZFNs). This article detailed described design of TALEN, two kinds of TALEN plasmid construction method and six kinds of mutation detection method to establish and improve the TALEN platform. The two method including Unit Assembly unit assembly and Golden Gate Vector based Assembly woμld be discribed. The five mutation screening systems included the digested resistance testing, SSA detection system, T7E1 enzyme and capillary electrophoresis detection system, T plasmid detection system and single clone detection system. We successfμ lly constructed TANLEN plasmid, and the establishment of the method of detection TALEN cutting resμ lts more. After assessing the degree of difficμ lty of the methods and compareing the advantages and disadvantages of mutation detection systems, we woμ ld like to give our advice of appropriate scope of application of all the six mutation screening