利用基因工程小鼠和gt1-using genetically engineered mice and gt1.docxVIP

东华大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权东华大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□。学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日东华大学王斯佳硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名职称职务工作单位备注李震研究员答辩委员会主席上海农科院孟清教授答辩委员会委员东华大学周兴平研究员答辩委员会委员东华大学杨雪霞副教授答辩委员会委员东华大学黄志伟副教授答辩委员会委员东华大学李凯副研究员答辩委员会委员东华大学杨光副教授答辩委员会委员东华大学林瑛副教授答辩委员会秘书东华大学利用基因工程小鼠和GT1-7细胞系研究miRNA对性发育的影响摘要背景：MicroRNAs(miRNAs)是一类长度大约为22nt的非编码小RNAs，它能通过靶向结合mRNA3端非编码区（3UTR）调控大量生物学过程包括细胞增殖与凋亡、神经元分化、肿瘤产生以及个体发育。本实验室之前的研究通过比较C3H/HeJ和C57BL/6两种近交系雌鼠间阴门开启时间的差异定位到了与性发育相关的基因：miR-505。此外，有研究表明miR-29基因家族成员中的miR-29a在哺乳动物大脑中高度表达，并且随着幼年个体生长发育，其在大脑中的表达量有着明显的波动，表明miR-29a可能在哺乳动物神经系统中发挥重要作用从而调控个体的生长发育。基因敲除技术是目前研究miRNA生物学功能的主要反向遗传学方法之一。而CRISPR-Cas9(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)作为一种来源于细菌和古细菌免疫系统的新型基因编辑工具，能够有效地引发靶基因突变进而导致基因功能丧失。目的：本研究尝试利用miR-505基因敲除小鼠，研究miR-505敲除对雌鼠性发育和生殖力的影响；利用CRISPR-Cas9技术在GT1-7细胞中对miR-29a进行基因敲除，检测miR-29a基因敲除GT1-7细胞的表型变化，探索miRNAs与性发育之间的联系。I方法：在动物实验方面，通过sgRNA/Cas9进行胚胎注射获得miR-505基因修饰小鼠，通过与野生型C57BL/6小鼠三代回交得到稳定遗传的基因修饰小鼠。通过进一步自交，获得三种基因型的子代，最后比较不同基因型雌鼠miR-505表达量情况、性发育和生殖力表型。在细胞实验方面，构建Cas9基因稳转的GT1-7细胞，并构建sgRNA29a-EGFP质粒转染上述GT1-7细胞，利用流式细胞仪富集阳性细胞和分选阳性单克隆细胞。最后对阳性单克隆细胞分别进行miR-29a表达量检测、表型分析和靶基因预测与验证。结果：在动物实验方面，胚胎注射获得了16只miR-505基因工程小鼠，其中有两只基因工程小鼠分别具有17bp和23bp的碱基缺失。荧光定量PCR结果显示，大片段缺失的基因工程小鼠的miR-505表达量有了显著的下降。虽然不同基因型雌鼠间miR-505表达量的显著差异没有引起性发育和生殖能力的统计学显著性变化，但是总体平均值显示雌鼠miR-505表达的缺失具有使阴门开启时间提前和增强部分生殖指标的趋势。在细胞实验方面，成功构建了稳定表达Cas9蛋白的GT1-7细胞模型，并利用该细胞模型完成了多种基因编辑。此外，流式富集后的表达绿色荧光蛋白阳性GT1-7细胞，其miR-29a突变率和表达量都发生了明显的变化。通过流式细胞仪获得了一个miR-29a基因修饰GT1-7单克隆细胞，它在miR-29a基因区段有2bp的碱基缺失。此外，miR-29a的表达量下降程度较富集细胞更高，而且miR-29a表达量的显著下降导致了GT1-7细胞生长速率的减缓和表型的变化。靶基因验证结果发现，DCX基因受到了miR-29a表达量变II化的影响。结论：利用CRIPSR-Cas9系统对miRNAs基因进行编辑能够有效降低miRNAs的表达量，即使CRISPR-Cas9系统造成的碱基缺失主要发生在miRNAs的加工区域。而Cas9稳转GT1-7细胞显著提高了基因编辑效率，并有利于后续利用流式细胞仪进行富集细胞。通过构建miR-505基因敲除小鼠模型发现，miR-505敲除对雌鼠性发育和生殖能力没有产生统计学显著的影响，但是总体平均值显示miR-505敲除雌鼠阴门开启的时间和部分生殖指标具有一致性的变化趋势。相比之下，miR-29a在GT1-7细胞中具有比较明显的生物学功能，并且可能通过调控DCX基因来实现。关键词：miR-29a，miR-505，CRISPR-Cas9系