连环素p120调控nf-catenin p120 regulates nf.docxVIP

目录主要缩略词表……………………………………………………………………….1摘要…………………………………………………………………………2第一部分脂多糖诱导的气道炎症反应中连环素p120对NF-κB信号通路的影响前言………………………………………………………………………………10材料和方法…………………………………………………………………………12结果…………………………………………………………………………27讨论…………………………………………………………………………35参考文献…………………………………………………………………38第二部分气道炎症中p120调控的NF-κB活化部分依赖RhoGTP酶家族蛋白RhoA前言………………………………………………………………………………..42材料和方法…………………………………………………………………44结果…………………………………………………………………………48讨论……………………………………………………………………………….58参考文献………………………………………………………………………..61综述一……………………………………………………………………………..64综述二……………………………………………………………………………..73附录………………………………………………………………………………..86致谢..………………………………………………………………………………87主要缩略词表p120p120-catenin连环素p120COPDchronicobstructivepulmonarydisease慢性阻塞性肺疾病IκBinhibitorofNF-κBNF-κB抑制蛋白HBECshumanbronchialepithelialcells人支气管上皮细胞E-cadE-cadherin上皮钙黏蛋白ELISAenzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附实验NF-κBnuclearfactorkappaB核因子kappaBPBSphosphatebuffersaline磷酸盐缓冲液EDTAethylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸BSAbovineserumalbumin牛血清白蛋白CCCcatenin-cadherincomplex连环蛋白-钙粘蛋白复合体PVDFpolyvinylidenefluoride聚偏氟乙烯JMDjuxtamembranedomain近膜区NLSsnuclearlocalizationsignalsequence核定位信号序列1中文摘要第一部分脂多糖诱导的气道炎症反应中连环素p120对NF-κB信号通路的影响一、目的本实验采用脂多糖（LPS）刺激体外培养的人气道上皮细胞建立气道上皮炎症反应模型，检测连环素p120（简称p120）蛋白的表达变化、NF-κB信号通路的活化及其下游靶基因IL-8的表达变化，初步探讨人体气道炎症发生的分子机制。二、方法根据MTT结果及本实验室前期研究，选取20μg/mlLPS作为致炎因子处理培养的人气道上皮细胞；运用免疫荧光、细胞核浆分离提取蛋白及Westernblot技术检测刺激前后p120、抑制蛋白IκBα及NF-κB亚基p65蛋白表达的改变及p65是否发生核内转位；运用ELISA和荧光实时定量PCR技术分别检测IL-8表达量的改变；运用瞬时转染及特异性siRNA技术以增强或敲低细胞中p120的表达，进一步验证p120与NF-κB信号通路之间的关系。三、结果Ⅰ．Westernblot、荧光实时定量PCR及免疫荧光染色证实p120存在于人气道上皮细胞中，而且，与对照组比较，LPS刺激后p120蛋白表达下调。Ⅱ．细胞核浆分离提蛋白及Westernblot技术检测发现LPS刺激人气道上皮细胞后，NF-κB信号通路活化——NF-κBp65总蛋白表达增多，而且转位入核，其抑制蛋白IκBα表达逐渐减少。同时，荧光实时定量PCR和ELISA显示NF-κB下游的靶基因IL-8的表达量较未给予LPS刺激的对照组明显增多，差异具有显著性。2Ⅲ．外源性高表达p120及siRNA技术使细胞中p120低表达后，进一步验证p120与NF-κB信号通路之间的关系。实验结果表明，外源性p120过表达后，NF-κBp65总蛋白量几乎无改变，p65未发生核转位，IL-8的表达水平变化不大。然而，LPS刺激后，过表达组IL-8表达较对照组明显降低（P0.001）。p120敲低后NF-κB信号通路显著活化——NF-κBp65总蛋白表达增多，p65转位入核，IL-8表达水平增加（P0.001）。进一步证明LPS诱导的气道炎症反应中，p120可能通过负性调控NF-κB信号通路抑制炎症反应。四、结论L