第七章 目的基因的分离技术知识 基因克隆课件.pptVIP

铜在营养学中的作用 缺铜6周的大鼠肝脏mRNA 正常大鼠肝脏mRNA 10个cDNA片段的差异 表达量是对照的1.2倍 新的未知基因 五、mRNA差别显示在甜菜无融合生殖基因克隆研究中的应用 被子植物无融合生殖使其子代继承了母本所有的遗传特性，并形成遗传上稳定的，可由种子繁殖的无性系。由此可以保存优异的基因型，固定杂种优势，并可能使一些重要的作物实现“一系法”育种；如果无融合生殖被很好地利用，它将是二十世纪六十年代“绿色革命”之后的又一次农业革命—无性生殖革命。 五、mRNA差别显示在甜菜无融合生殖基因克隆研究中的应用 植物界中，无融合生殖广泛存在。我们通过栽培甜菜（Beta vulgaris L.）与白花甜菜（B.corollifora Zoss）远缘杂交获得了真实杂种，经遗传回交获得了带有白花甜菜染色体的完整单体附加系系列，并且通过单体附加系传递研究，筛选出近100%高频率传递的单体附加系M14品系。经过标记基因杂交、传递遗传形态观察、胚胎学及分子生物学鉴定它们是兼性无融合生殖的,1999年3月经专家鉴定为无融合生殖品系；同时无融合生殖基因已经定位在这条附加的白花甜菜染色体上，因此M14品系是克隆无融合生殖基因的极为难得的材料。 甜菜单体附加系M14品系 ( VV+1C, 2n = 19 = 18+1, 箭头所指为附加的白花甜菜染色体 ) 五、mRNA差别显示在甜菜无融合生殖基因克隆研究中的应用 采用mRNA差异显示技术比较甜菜无融合生殖系及正常进行有性生殖的二倍体栽培植株在无融合生殖基因表达的三个关键时期，即大孢子母细胞减数分裂期、助细胞提前退化期、次生核自行分裂期mRNA的差异，是进行克隆无融合生殖相关基因的比较有效的方法 五、mRNA差别显示在甜菜无融合生殖基因克隆研究中的应用 1、对总RNA进行逆转录反应，合成cDNA第一链。 （1）共采用三种锚定引物：T15A、T15G、T15C （2）制备锚定引物-RNA混合物，变性RNA样品 ① DEPC-treated H2O 14.3 μl 锚定引物 2.2 μl ② Total RNA（μg/ μl） 2.5 μl ①混合物 7.5 μl 混匀，将离心管置于70℃10分钟，结束后立即放于冰上。 （3）制备2X反应混合液，放置冰上，体系如下： DEPC treated H2O 4.2 μl 10XSynthesis buffer 4.2 μl 25mM MgCL2 4.2 μl 0.1mM DDT 4.2 μl 10mM dNTPs 2.1 μl Super script II 2.1 μl 混匀后，取10 μl该混合液加入到“②”中混匀。 （4）将混匀后的试管置于PCR热循环仪内，按下列程序合成cDNA第一链。 25 ℃ 10min,42 ℃ 50min ,90 ℃ 5min ,4 ℃ 贮存。 （5）cDNA第一链合成结束后，于试管内加入76 μl TE，4 μl 50 μM的相同锚定引物，-20 ℃贮存。 2、PCR反应合成双链cDNA片段 （1） 配制Master Mix I ddH2O 12.6 μl X2N 10xPCR Buffer 2.0 μl X2N 25mM MgCL2 1.2 μl X2N 10mM dNTPs 0.25 μl X2N Taq DNA Polymerase (5U/ μl ) 0.2 μl X2N 混匀，离心。 （2）配制 Master Mix II