第三章 基因操作的主要技术知识原理 基因工程 .ppt

Northern Blotting 相对Southern blotting命名的，与Southern blotting不同的是，它检测的对象是RNA分子。 Western Blotting 杂交的对象是蛋白质，先将蛋白质从SDS中转移到一固相支持物上，通过与附着于固相支持物上的靶蛋白所呈现的抗原抗体特异反应进行检测 主要用于基因的表达产物蛋白质的检测 第五节 PCR技术 一、PCR技术的基本原理 Polymerase chain reaction, PCR 聚合酶链式反应 A method for amplifying specific DNA segments that exploits certain features of DNA replication. 一个DNA经n次扩增后, 一个DNA分子可变为2n 理论上经过30次循环，靶DNA得到109倍的扩增，实际是106~7倍的扩增 DNA扩增需要对待扩增的DNA序列有所了解，至少要对其两侧的核苷酸序列为已知，以便合成寡核苷酸引物 二、PCR反应的各种组份及作用 一个标准的PCR反应体系（50~100 μl） 50 mmol/L KCl 10 mmol/L Tris-HCl（pH=8.4） 1.5 mmol/L MgCl2 100 μg/ml 明胶或牛血清白蛋白（BSA） 2个引物，各0.25 μmol/L dNTP=dATP+dCTP+dGTP+dTTP） 各200μmol/L 模板DNA（人基因组DNA） 0.1~1μg Taq DNA聚合酶 2 U Denaturation 94 ℃, 0.5min Primer annealing 55 ℃, 1.5mion Extension 72 ℃, 1min 30 cycles 变性（模板）－退火（引物与模板）－延伸（新合成DNA链） 1. 模板DNA 用于PCR扩增的模板DNA通常是从细胞中提取的染色体DNA，它们并不需要高度纯化。 待扩增的靶DNA的长度在3kb以下是PCR的有效扩增范围，采用经改造的Taq DNA聚合酶可扩增出40 kb的DNA 片段。 2. 引物 PCR引物是与待扩增的目的DNA两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片段 引物的长度通常为17~30个核苷酸 引物太短，可能同非靶DNA杂交，得出非预期的扩增产物； 引物太长，引物与模板的结合效率降低，影响扩增效率。 如8nt的引物，平均每48=65536 bp就会有一个结合位点，在全长为3×109 bp的人类基因组中，大约有43000个可能的结合位点，不能得到单一的特异性扩增产物。 如为17nt的引物，出现几率为417=17,179,869,184 bp，长度超过人类基因组长度的5倍，故在人类基因组中只可能有一个结合位点。 但引物不是越长越好，过长的引物同模板DNA的杂交效率反而下降，从而降低PCR反应的效率。 简并引物 是一类由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间只有一个或数个核苷酸的差异。如根据氨基酸序列推测出的核苷酸序列。 引物与复性温度 引物与模板结合的特异性与复性温度有密切关系 当复性温度偏低时，引物与模板配对出现错配碱基，导致一些不需要的DNA片段被扩增 复性温度过高，引物与模板不能配对 复性温度常与引物的长度和碱基组成有直接关系，引物越长或GC含量较高，退火的温度可以高些，反之则低些 Tm=4×(G＋C)＋2×(A＋T) ℃ 1~2 ℃ below 基本原理： 双脱氧（2，3）-核苷酸可以象2-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的DNA链中，但因3’ 端不具OH基，DNA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列 过程：制备ss-DNA→与引物退火→分为4个反应系统→每个系统中加入dNTP（其中dATP常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸→DNA聚合酶定序反应→反应产物变性后电泳→凝胶干燥→放射自显影 DNA Sequencing Reactions The DNA sequencing run is similar to the PCR run. The run mix includes the template DNA, Taq polymerase, dNTPs, ddNTPs, and a primer: a small piece of single-stranded DNA 20-30 nt long tha