总RNA提取和QPCR标准操作流程.docxVIP

总RNA提取及反转录标准操作流程一、仪器试剂Trizol试剂三氯甲烷（4℃预冷）异丙醇（4℃预冷）75%乙醇（DEPC处理水配置）（4℃预冷）DEPC处理水/RNase free water（反转录试剂盒）1.5mL无酶EP管200μL无酶PCR管冷冻离心机Nano Drop 2000反转录试剂盒（Takara RR036A）二、实验须知1. 选择人员走动较少的实验台或超净台（无须打开风机）操作。2. 操作及观摩人员必须佩戴干净的一次性手套及口罩。3. 尽可能在冰盘上操作。3. 取EP管时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管后，袋子及时封好。4. Trizol含剧毒，若溅到皮肤上，请立即用清水冲洗；若溅到眼内，立即大量清水冲洗，并送医就诊。三、样品处理1. 组织样品将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解。注1：样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。注2：组织样品收取后应立即处理或液氮冷冻并-80摄氏度保藏。胰腺组织样品因其各种酶含量极其丰富，应尤为注意，研磨过程中注意保持样品低温状态。2. 贴壁细胞样品弃去细胞培养皿中培养基，根据下表加入适量 Trizol溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml 无酶EP管中，室温静置5min，使细胞充分裂解。培养皿Trizol体积3.5cm皿（6孔板）1mL6cm皿3mL10cm皿10mL注：加入Trizol溶液后，可将培养皿放入-80℃冰箱，20min后取出化开，通过冻融增加细胞裂解效果。3. 悬浮细胞500g×5min离心收集细胞，弃去培养基，约5-10×106细胞加入1mLTrizol溶液，吹打混匀，室温静置5min，使细胞充分裂解。注：某些酵母或细菌细胞须超声裂解。4. 注意事项1）样品裂解液可室温存放数小时，-80℃可至少存放一月。2）若样品含大量脂肪、蛋白、多糖及包外物质，如脂肪、肌肉或块茎植物等样品，可增加一步离心操作，具体步骤如下： 12000g、4℃离心10min，胞外基质、多糖、高分子量DNA将会形成颗粒沉淀于底部，RNA包含于上清中，而高脂样品会在上清液上方形成一层脂肪层。 移除脂肪层，将澄清的上清液移至新的无酶EP管中。四、总RNA提取1. 每1mL Trizol溶液加入200μL三氯甲烷，立即盖上盖子，剧烈振荡15s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min。2. 4℃下，12000g离心15min，液体分为三层，RNA位于上层水相，约占总体积的50%，移至新无酶EP管中（用20-200μL的枪吸取上清，吸上清时，EP管倾斜大约45度，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）。3. 加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次，不应用振荡器混匀），室温静置10min。4℃下，12,000g离心10min，可见羽毛状白色RNA沉淀，小心吸出上清。4. 1mL 75%乙醇洗涤两次（4℃ 7500g离心5min，加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不可使用振荡器震荡或枪头吸打沉淀）。注：RNA可与75%乙醇中4℃保存一周，-80℃保存一年。5. 室温干燥室温或真空干燥5-10min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。视沉淀量加入适量DEPC水（至少15μL）溶解沉淀，使用Nano Drop测定RNA浓度。6. 首次提取RNA时须跑胶验证RNA质量，核酸胶配置为：1%琼脂糖/1×TAE缓冲液，取5μLRNA溶液混上0.5μL Loading Buffer，上样跑胶，电泳大概15min，凝胶成像仪上观察RNA条带质量，RNA条带一般为三条，理想的RNA条带为：明亮的28S条带与18S条带，并且28S条带亮度大约为18S条带两倍，微弱或没有5S条带。五、反转录用Prime Script TM反转录试剂盒（Takara RR036A）将总RNA反转录成cDNA。1. 于200μL无酶PCR管中按反应体系配置RT液。反应体系如下：试剂使用量终浓度5× Prime Script RT Master Mix（Perfect Real Time）2μL1×总RNA500ngDEPC处理水补足至10μL2. 轻柔混匀后进行反转录应 ，条件如下：37℃ 15min （反转录反应）85℃ 5sec （反转录酶失活反应）4℃3. 得到的RT反应液使用Nano Drop测定cDNA浓度，-20℃保存。QPCR标准操作流程一、QPCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行绝对定量分析或通过内参对比进行相对定量分析的方法。本实验室常采用相对定量进行分析。1. SYBR Green：在P