蛋白样本制备与WB5.pdfVIP

蛋白样本制备 蛋白样本制备 与Western Blot 与 主要内容 主要内容 一 蛋白样本制备的目的与重要性 一 蛋白样本制备的目的与重要性 二 蛋白样本制备的总体策略和原则 二 蛋白样本制备的总体策略和原则 三 案例分析—细胞总蛋白的提取 三 案例分析—细胞总蛋白的提取 1 细胞裂解液配方分析与技术要点 2 表面活性剂的选择 1 细胞裂解液配方分析与技术要点 2 表面活性剂的选择 3 蛋白酶抑制剂与其”鸡尾酒” 4 磷酸酶抑制剂 3 蛋白酶抑制剂与其”鸡尾酒” 4 磷酸酶抑制剂 四 蛋白提取产品选择指南 四 蛋白提取产品选择指南 1 核蛋白与转录因子EMSA分析 1 核蛋白与转录因子EMSA分析 2 膜蛋白提取 2 膜蛋白提取 3 多种蛋白的分级提取 3 多种蛋白的分级提取 五 蛋白定量方法的选择 五 蛋白定量方法的选择 六 成功的 Western Blot 1 WB原理与方法 1 WB原理与方法 2 WB的成功要素 2 WB的成功要素 3 常见问题分析与解决方法 3 常见问题分析与解决方法 一 蛋白样本制备成功蛋白分析的基础 一 蛋白样本制备成功蛋白分析的基础 1 蛋白样本制备的目的: 后续应用于: 1 蛋白样本制备的目的: 后续应用于: activity assays protein microarrays SDS/IEF immunoblotting(Western Blotting) ELISA EMSA(gel shift) two-dimensional gel electrophoresis(2D), mass spectrometry 2 蛋白样本制备的重要性: 蛋白样本制备是蛋白试验的第一步,更是最重要的步骤!是决定试验成败的关键! 但却往往是最容易被忽视的步骤! 误解1:认为简单 误解2:方法单一 细胞内蛋白质的复杂性 细胞内蛋白质的复杂性 种类多:数千种,并且是混合物(与核酸多糖脂质小分子混一 种类多:数千种,并且是混合物(与核酸多糖脂质小分子混一 起) 起) 分子大小分布范围宽:几百个至上万氨基酸,多数为1万-- 分子大小分布范围宽:几百个至上万氨基酸,多数为1万-- 15万道尔顿 15万道尔顿 含量不均:某种可能占总蛋白的10%,有些只占0.001%以 含量不均:某种可能占总蛋白的10%,有些只占0.001%以 下 下 性质多样:正电或负电荷\极性或非极性\亲水或疏水,二级 性质多样:正电或负电荷\极性或非极性\亲水或疏水,二级 结构或空间结构形成大小形状残基分布等均不同的分子 结构或空间结构形成大小形状残基分布等均不同的分子 二 蛋白样本制备的原则 二 蛋白样本制备的原则 方法应具备标准化具有重现性 可靠性和简便性 方法应具备标准化具有重现性 可靠性和简便性 尽量抽提完全 尽量抽提完全 应使所有蛋白全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋 应使所有蛋白全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋 白） 白） 防止发生蛋白的降解聚集 沉淀 变性 防止发生蛋白的降解聚集 沉淀 变性 防止在抽提过程中发生化学修饰（如酶性或化学性降 防止在抽提过程中发生化学修饰（如酶性或化学性降 解等） 解等） 如做2D则需去除高丰度蛋白或无关蛋白 如做2D则需去除高丰度蛋白或无关蛋白 必要时去除