荧光抗体的制备1.pptVIP

* * 第五讲 荧光抗体的制备 一、标记用荧光素 1 基本条件 （1）具有化学活性基团，如异硫氰基（-NCS） （2）易与免疫球蛋白结合形成共价键 （3）对免疫球蛋白无毒性，不影响抗体活性 （4）荧光素性能稳定，结合物性能稳定 （5）结合物的颜色与组织背景有良好反差 2 常用荧光素 （1）异硫氰酸荧光素（C21H11O2N5) 为黄色粉末，有结晶和粉末型两种，结晶型荧光强度大，稳定，优于后者。 分子量389，溶于水，易溶于pH8.0-9.5的CBS buffer中，最大吸收波长为495nm，最大发射波长520nm。 FITC性质稳定，低温可保存2年以上，标记的分子基础是-NCS与抗体中的赖氨酸的氨基结合，1个IgG有86个赖氨酸残基，一般可标记16-20个荧光素分子。 FITC是目前已发现最好标记用的荧光素分子，其余像RB200也可用于标记 二、标记方法 1 搅拌法 （1）取一定量的纯IgG液，用0.5 mol/L 的碳酸盐 buffer（pH 9.5)稀释至20mg/mL （2）按荧光素与蛋白质比1：20~1：100(一般1： 100）称取FITC，用0.5 mol/L 的碳酸盐 buffer（pH 9.5)溶解 （3）将IgG液置于磁力搅拌器上，轻轻搅拌，不起泡沫。逐滴加入荧光素液（15-30min加完）。 （4）加完后，随时用试纸测定搅拌液的pH，若低于9.0，则以碳酸钠溶液调整 （5）4℃搅拌6 h左右 2 透析法 （1） 将IgG液用0.5 mol/L 的碳酸盐 buffer（ pH 9.5)稀释成1%浓度，装入透析袋 （2）将FITC配成0.1mg/ml，其体积为1% IgG液的10倍，装入烧杯中 （3）将透析袋置于烧杯中，置于磁力搅拌器上， 4℃搅拌24 h左右 透析法的优点是标记均匀，非特异性荧 光少，但标记的时间长，荧光素的用量比搅 拌法多10倍。 三、标记抗体的纯化 1 除去游离的荧光素 透析法 将标记好的抗体装入透析袋中，置10mmol/L的PBS中4℃透析，6h左右换透析液一次，直到透析液中无游离色素为止。通常需要5-7天。 凝胶过滤法 以sephadex G50装柱，标记物先出来。该法速度快，一般1h左右可完成。 也可以先透析4-5h，让大部分游离的FITC除去，再过柱 除去过度标记的IgG 采用DEAE-纤维素柱法 （1）10mmol/L PBS液洗脱 （2）同样PBS（含0.05mol/L NaCl）洗脱 （3）同样PBS（含0.1mol/L NaCl）洗脱 （4）同样PBS（含0.2mol/L NaCl）洗脱 收集每部分有荧光抗体的洗脱液管，于495nm测荧光素OD，再于 280nm测蛋白质的OD，查标准曲线，算出各管荧光素和蛋白质的浓度，并计算F/P的比值，将合格者合并，浓缩分装。 层析柱上滞留的过度标记的IgG，可用1mol/L NaCl洗脱 四、标记抗体的鉴定 1 F/P比值鉴定 荧光素与IgG的结合率即F/P比值，分别制备荧光素与IgG的标准曲线。 FITC： 0.5 mol/L 的碳酸盐 buffer（ pH 9.5) 将FITC分别配成0.25、0.5、0.75、1.0、2.0至10.0ug/ml的浓度， 495nm测荧光素OD，并制备浓度与OD的标准曲线 *