HPLC色谱条件的优化与色谱2.(凌老师) new ppt.pptVIP

HPLC色谱条件的优化与色谱技术进展 凌大奎 一、分离度方程式 动力学 热力学 Rs=1/4 N ·K / (K＋1)·(α－1) /α 柱效 保留时间 选择性 混合物中不同组分在两相间平衡分配性质的 差异是色谱分离的基础，研究物质平衡分配的内 容属于色谱热力学的范畴。 容量因子K决定了组分的保留时间，而分离因 子α决定了组分的分离选择性。这二个重要的色 谱参数都取决于溶质、固定相和流动相的热力学 性质。在溶质、固定相和流动相的某种组合下， 只要不同组分的平衡分配性质存在差异，而且这 种差异又足够大时，就有可能实现分离。 要使分离的可能性变为可行，则必须设法控制色谱过程中使色谱峰发生展宽的各种外在因素。色谱峰的展宽主要决定于柱填料的性质以及填装质量，例如填料颗粒大小、粒径分布、形状、表面积、孔径、孔体积，等等。研究柱效与各种影响因素的关系是色谱动力学的内容。 1、Rs分离度 a）Rs=2（tR2-tR1）/（W2+W1）或 1.18（tR2-tR1）/（W2,h/2+W1,h/2） b）Rs＜0.8 不符合分析化学要求 Rs=1 二峰重叠2% Rs＞1.2 二峰完全分离 2、K 容量因子 a）K=（tR-tO）/to b）K对分离度的影响 Rs α k/（K+1） 一般K取2-10，以2-4最好。 c）改变K的方法 改变流动相的溶剂强度（常以溶剂的溶解 度参数或极性参数表示）。 常用溶剂的溶解度参数δ（25℃） 对于大多数溶剂，极性参数（p）与溶解 度参数（δ）基本呈平行关系。 混合溶剂的溶剂强度按体积比取加权平 均值。 溶剂强度2个单位的变化一般可引起容量 因子10倍的变化。 3、N 理论塔板数 a）N=16（tR/W）2或5.54（tR/Wh/2）2 b）N对分离度的影响 Rsα N c）提高柱效的方法 ● 增加柱长 ● 改进柱填料（纯度、物理性状） ● 提高填装质量 4、α 分离因子 a）α= K2/K1 = t＇R2 / t＇R1 b）α对分离度的影响 Rs α（α-1）/α 影响敏感，α的微小变化可显著改变Rs c）改变α的方法 在保持流动相极性基本不变的前提下， 适当改变流动相的组成、组分的比例或添加 调节剂。 5、N与α对Rs贡献的比较 二、Van Deemtor方程 h=A·F1/3+B/F+Cm·F+Cs·F=A·F1/3+C·F 式中 h=1/N 理论塔板高度 F=流动相流速 Cm，Cs=溶质在流动相和固定相中的浓度 B=纵向扩散的贡献因子（纵向浓度梯度） A=涡流扩散的贡献因子（色谱柱的不均匀性） 溶质在液体中的扩散系数比气体中小4—5个数 量级，所以在HPLC中在通常的流速条件下B项的贡献可忽略 不计。 1、柱效与流速的关系 存在最佳流速 2、柱效与填料粒径的关系 a）A=2λ·dp 式中 2λ为与填充均匀性有关的因数 dp为填料的粒径 b）小的dp有利于传质 c）减小填料粒径可显著提高柱效 由上表可见，减小dp可显著提高柱效→缩短 恒压 色谱柱 → 增加流速 ↓ ↓ 缩短洗脱时间 三、影响分离效果的其他因素 1、温度 柱温提高到40℃以上，谓之 HTLC（40℃—200℃） ● 温度上升→流动相粘度下降→流速增加 （≤8ml/min）→容量因子K下降→保留时 间缩短 ●粘度降低→柱压下降→可采用细粒径填料 （＜3um）或长色谱柱→提高柱效 ●提高灵敏度 色谱峰高与柱温呈指数函数关系，即峰高的对数与柱温呈线性关系 峰高随柱温呈指数增加时，灵敏度也呈 指数增加，数据表明，柱温从30℃上升至 90℃，定量限约可降低10倍。 ●改善选择性 不同溶质的保留时间随柱温变化的程度不尽相同，有可能使原来未分离的成分的得到基线分