《病原生物与免疫学实验》实验六.pptVIP

实验六白喉杆菌、厌氧菌、分枝杆菌病毒及其它微生物 实验内容 操作 白喉棒状杆菌（吕氏血清斜面）：Albert染色法 病毒血凝试验 示教 破伤风梭菌及产气荚膜梭菌的培养特性 结核分枝杆菌的培养特性 病原性真菌形态、培养特性 血凝抑制试验 示教片：观察结核分枝杆菌、钩端螺旋体、新型隐球菌和病毒包涵体的形态 目的要求 熟悉白喉棒状杆菌的形态 熟悉结核分枝杆菌的形态和培养特性 熟悉破伤风梭菌及产气荚膜梭菌的培养特性 了解病原性真菌形态和培养特性 掌握钩端螺旋体、病毒包涵体的基本形态 了解恙虫病立克次体的基本形态 了解病毒血凝试验、血凝抑制试验的方法，掌握基本原理 病毒的血凝试验 血凝素（hemagglutinin HA）：由病毒基因编码的糖蛋白刺突。与病毒吸附和传入宿主细胞有关。HA能与人或其它动物多种红细胞表面N－乙酰神经氨酸酶受体结合引起红细胞凝集。 滴定病毒的血凝效价，采用一定的病毒量，通常采用4个血凝单位。 血凝试验结果判定 结果判定：薄层（凝集） 圆点（不凝集） 凝集特别显著：“＋＋＋＋” 凝集现象次之：“＋＋＋” 凝集清楚可见：“＋＋” 稍显凝集者：“＋” 血凝单位：呈“＋＋”凝集时的最高稀释度。此时的稀释度即为1个血凝单位。 示教：结核分枝杆菌的培养特性 专性需氧，最适37℃ ，营养要求高，生长缓慢，18h分裂一代。罗氏(Lowenstein-Jensen)培养基含蛋黄、甘油、马铃薯、无机盐、孔雀绿，2~6周可见菌落生长 菌落特点：菜花、颗粒或结节状菌落，乳白色或黄色，不透明。 血凝抑制试验 原理 病毒引起的血凝现象能被相应的抗血凝素抗体所抑制，称血凝抑制。利用血凝素特异性抗体与病毒表面相应的HA相互作用，使病毒血凝现象抑制的试验称血凝抑制试验。 4个血凝单位的病毒液 血凝抑制试验结果判定 测定孔：圆点 （不凝集） 薄层（凝集） 血清对照孔： 圆点（不凝集） 病毒对照孔：薄层（凝集） RBC对照孔：圆点（不凝集） 血凝抑制试验效价：呈完全血凝抑制的最高血清稀释度。 结核分枝杆菌抗酸染色法示教片 内基小体示教片 新型隐球菌示教片 * Albert染色法 制片同革兰染色， 甲液染5分钟→水洗→再以乙液（碘液）染1分钟 →水洗→印干→油镜检 白喉棒状杆菌(C.diphtheriae) Albert染色：见异染颗粒，菌体蓝绿色，异染颗粒蓝黑色（用于鉴定） 各0.5ml 鸡红血球细胞悬液（ml） 对照 1∶1280 1∶640 1∶320 1∶160 1∶80 1∶40 1∶20 1∶10 病毒稀释度 0.5 0.5弃掉 0.5 + 0.5 0.5 + 0.5 0.5 + 0.5 0.5 + 0.5 0.5 + 0.5 0.5 + 0.5 0.5 + 0.5 0.9 + 0.1 生理盐水（ml） 病毒液 （ml） 9 8 7 6 5 4 3 2 1 孔号 血凝试验（血凝效价的滴定) 将有机玻璃板孔从1~9进行编号，从第1孔起至第9孔，按下表加。 将病毒液按下表进行稀释。 自第9孔开始反方向向前每孔加入0.5%鸡红血球0.5ml，摇匀后放置室温45分钟 分解乳糖产酸，指示剂变黄，培养基凝固,产生大量气体,呈蜂窝状,将液面凡士林上推,甚至冲走管口棉筛。“汹涌发酵” 牛奶培养基 分解肉渣中糖类而产生大量气体。 菌落平整，光滑，边缘齐。有双层溶血环：内层完全溶血(θ 毒素引起)，外层不完全溶血(α 毒素引起) 产气荚膜梭菌 肉汤混浊，肉渣部分被消化，呈灰白色 37℃ 48h，薄膜状爬行生长物，边缘不齐，伴轻度β 溶血 破伤风梭菌 庖肉培养基 血平板 示教：破伤风梭菌及产气荚膜梭菌的培养特性的培 养 特 性 黄曲霉 示教：真菌的培养特性 多细胞真菌：观察气生菌丝，营养菌丝，表面隆起，浅沟及菌落基底颜色。 单细胞真菌： 酵母型菌落 新型隐球菌：菌落圆形，较大，湿润呈蜡状，乳白色 类酵母型菌落 白假丝酵母菌：：菌落圆形，较大，白色菌落底层有假菌丝 抗酸染色法(acid-fast stain) ：以5％石炭酸复红染色，再用3％盐酸酒精脱色，然后用美蓝复染，则分枝杆菌呈红色(+)，其他细菌和背景物质为蓝色(-)。 实验过程：取痰液→ 涂片（略厚）→干燥→固定 → 石炭酸复红染色8~10分钟后→用3%的盐酸酒精脱色约1~2分钟，脱色时轻摇玻片，直到涂片颜色脱去为止→ 水洗后，用碱性美蓝复染1分钟→水洗，印干 → 镜检 Fon