植物染色体DNA的提取及浓度测定.docVIP

XXXXXXX大学 作业题目： 植物染色体DNA的提取及浓度测定 课程名称： 遗传学研究技术 任课教师姓名：XXXXXXXX 研究生姓名： XXXXXXXXX 学 号 XXXXXXXXX 年 级： 2010级 专 业： 动物学 学院（部、所）：生命科学学院 任课教师评分： 评阅意见： 任课教师签名： 2010年11月18日 植物染色体DNA的提取及浓度测定 2010级动物学 XXXXXXX 目的意义 DNA是遗传信息的载体和基本遗传物质，它在遗传变异、代谢调控等方面起着重要作用，是分子生物学和基因工程研究的对象，但无论是研究植物DNA的结构和功能，还是开展外源DNA的转化、转导的研究，首先要做的就是从植物组织中提取天然状态的高分子量的纯化DNA。因此，本实验的目的是学习植物基因组DNA提取方法、原理和DNA的鉴定技术。 植物基因组DNA 的提取（CTAB法） 一、原理 植物组织中绝大部分是核DNA，它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白（即染色质或染色体）的形式存在于细胞核内。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide，简称CTAB)：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度(0.3mol/L NaCl)时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。 在DNA提取过程中必须始终注意以下几个关键问题： （1）DNA的二级结构和双链易受多种因素（如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等）的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避免使用变性的条件。 （2）抑制内外源DNase的活力。DNase就象一把刀，它能把大分子的DNA切成碎片，所以要加以杜绝，现可以通过多种途径来做到这一点：a、低温操作；b、调节pH，使偏碱（pH8.0）；c、抽提液中加表面活性剂；d、加螯合剂（EDTA）除去酶的铺助因子（Mg2+），使酶活性丧失。 （3）防止化学降解。如过酸或过碱以及其它化学因素，会使DNA降解，一般综合考虑，取pH8.0左右为宜。 （4）防止物理因素降解。如温度太高或机械张力剪切等，DNA分子特别大，其分子量可达1012道尔顿，极易被机械张力拉断，甚至在细管中稍急一些的流动也会使DNA断裂，所以在抽提过程中要特别注意这一点，操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数，也不要剧烈摇动。 （5）植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类或色素类化合物）对核酸提取有干扰作用。因此，一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取DNA的材料，这是因幼嫩的新生组织次生代谢物较少，DNA含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鲜的。 分离提取植物DNA的方法很多，本实验采用CTAB法提取DNA并通过紫外吸收法和电泳鉴定。 二、操作方法 （1） 取200mg样品(在液氮中研磨成粉末状)放入1.5mL离心管中，加入600μL DNA提取液，颠倒混匀5-6次。65保温35分钟以上，其间颠倒混匀一次。 （2）再加等体积的氯仿异戊醇(24：1)溶液轻轻摇晃30秒，在4下10000rpm/分钟离心10分钟后，取吸上清液(450μL) （3） 再加两倍体积的预冷异丙醇，混匀静止10分钟以上，在4下10000rpm/分钟离心10分钟后，弃上清。 （4） 用600μL70%乙醇洗涤沉淀，重复一次，在室温下倒置晾干。 （5）沉淀用TE溶液溶解DNA，再加入RNase至终浓度50μg/mL，在37下保温半小时，将DNA样品放入冰箱保存。 植物DNA 纯度的鉴定——紫外分光光度计法 一、原理 由于核酸中的碱基都具有共轭双键，所以具有紫外光吸收性质。核酸在紫外光谱区有一条典型的吸收曲线，其吸收高峰在260nm处，吸收低谷在230nm处。蛋白质在紫外区的吸收高峰在280nm处，所以核酸的紫外吸收光谱数据是鉴定核酸的重要依据之一。但紫外法不能区分DNA和RNA，只能用来鉴定核酸的纯度和含量。 纯度鉴定时，需测定在230、260和280nm处的消光值，经验数据表明， 纯净的核酸溶液A260