枯草芽孢杆菌嘌呤合成路径的优化对腺苷积累的作用.docVIP

枯草芽孢杆菌嘌呤合成路径的优化对腺苷积累的作用 　　腺苷( Adenosine) 化学名为 6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-9-氢嘌呤，在医药和食品领域有广泛的应用。早在 20 世纪 50 年代，应用微生物发酵法生产腺苷的研究就已经开始，但是对腺苷研究的报道主要集中在菌种的选育和培养基的优化，使用基因工程技术改造腺苷生产菌的研究却很少。本实验室保藏的腺苷生产菌 Bacillus subtilisXGL，是通过长期诱变筛选而成，但是进一步诱变对产苷影响不大，要获得更加优良的菌株，需要利用新的方法对其进一步改造。 　　前期研究显示，对嘌呤合成途径改造，改变途径中关键酶的活性进而影响嘌呤合成速率，可以有效地提高肌苷、核黄素的产量。因此，嘌呤合成途径的强弱直接影响核苷类物质的合成。嘌呤合成途径的重要中间代谢物肌苷酸( IMP) 是腺苷合成的直接前体物，肌苷酸的供应很可能是工程菌中腺苷合成通量的主要限制因素之一。因此，增加葡萄糖到IMP 的合成途径通量能够提高腺苷合成中前体物的供应，继而促进腺苷的积累。 　　在枯草芽孢杆菌中，嘌呤核苷酸合成相关的基因组成嘌呤操纵子，嘌呤操纵子( purEKB-purC( ORF) QLF-purMNH( J) -purD) 全长 13339 bp，由于嘌呤操纵子整体较大，而嘌呤合成途径中关键酶PRPP 转酰胺酶编码基因 purF 位于嘌呤操纵子的中下游，距离启动子较远，转录效率不高。因此本研究以 B． subtilis XGL 为出发菌株，以温敏质粒 pKS1 为骨架，构建整合质粒 pKF，利用单交换的方式将强启动子 P43 插入至嘌呤操纵子中，不仅过表达了嘌呤合成途径中关键酶 PRPP 转酰胺酶编码基因 purF，而且其下游基因 purM、purN、purH 和 purD 表达水平也得到不同程度的提高。这些相关基因的共同表达将比单一增强表达 purF 基因催化更多的嘌呤前体物谷氨酰胺、甘氨酸、10-甲醛四氢叶酸进入嘌呤途径，将更加有效地提高嘌呤合成途径通量。 　　1、 材料和方法 　　1. 1 材料 　　1. 1. 1 菌株和质粒: 表 1 为本研究所用菌株和质粒。 　　1. 1. 2 引物: 表 2 为本研究使用的引物，均由Primer Premier 5. 0 软件设计。 　　 　　1. 1. 3 培养基:种子培养基( g/L) : 葡萄糖 20，酵母粉 5，味精 5，蛋白胨 8，尿素 5，黄嘌呤 0. 03，L-组氨酸 0. 03，MgSO4·7H2O 0. 4，KH2PO41，玉米浆 25mL，豆饼水解液 10 mL，pH 7. 0。摇瓶发酵培养基( g/L) : 葡萄糖 80，味精 10，黄嘌呤 0. 03，L-组氨酸0. 03，酵 母 膏 5，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0. 4，( NH4)2SO45，CaCO320 ( 干热灭菌) ，豆饼水解液15 mL，玉米浆 15 mL，pH 6. 7，灭菌条件均为 115 ，15 min。培养基必要时添加 5 μg / mL 的红霉素。发酵罐发酵培养基( g/L) : 葡萄糖 80，味精 12，酵母膏 18，葡萄糖酸钠 1. 5，黄嘌呤 0. 03，L-组氨酸0. 03，( NH4)2SO412，MgSO4·7H2O 5，K2HPO42，MnSO40. 06，FeSO40. 06，CaCl22，玉米浆 15 mL，pH6. 7。其中葡萄糖分消灭菌，灭菌条件均为 115 ，15 min。工程菌种子培养基添加 5 μg / mL 的红霉素。 　　1. 1. 4 主要试剂和仪器: Solution I 连接酶和 RNA提取试剂盒，大连宝生物工程有限公司; Taq DNA 聚合酶，北京全式金生物技术有限公司; 限制性内切酶和 1 kb DNA marker，Fermentas 公司; UltraSYBR 二步法荧光定量 PCR 试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司; 质粒小量快速提取试剂盒，北京博迈德生物技术有限公司; PCR 产物纯化试剂盒和胶回收试剂盒，北京天恩泽基因科技有限公司; 引物合成与基因测序，北京华大基因。实时定量 PCR 仪，美国ABI 公司; 电穿孔仪，Eppendorf 公司; 高效液相色谱系统，美国安捷伦公司。 　　1. 2 感受态的制备及转化 　　枯草芽孢杆菌的制作方法与转化方法参考文献，载体连接化学转化感受态制备及质粒连接体系转化均参照连接试剂盒和化学转化试剂盒说明书进行。 　　1. 3 实时定量 PCR 分析 　　将 B． subtilis XGL 和 B． subtilis XGLF 菌株接于5 mL 摇管过夜培养，以 1% 的接种量接种于 30 mL的 LB 培养基中培养至对数期，按照 RNA 提取试剂盒说明书