基因克隆的酶学基础.pptVIP

1. 来源： （1）限制（Restriction） ② 不完全同裂酶 DNA 连接酶 二、DNA ligase的特点 2. 连接条件 4.热稳定DNA连接酶 DNA片段 第三节 DNA聚合酶 二、常用的DNA聚合酶的特点 3. 常用DNA聚合酶的特性比较 第四节 DNA修饰酶 4. 末端转移酶的用途 （2）再生酶切位点 二、碱性磷酸酶 2. 碱性磷酸酶的特性 常用的有噬菌体SP6、T7、 T3 RNA聚合酶，其中SP6 RNA聚合 酶来源于SP6噬菌体感染的鼠伤寒沙 门菌(Salmonella typhimurium)， T7、T3RNA聚合酶源自大肠杆菌， 目前这些RNA聚合酶已能用基因工程 的方法大量制备。 SP6、T7、T3 RNA聚合酶可以分别识别 双链DNA模板上相应的噬菌体特异性启动子， 以ATP、GTP，CTP和UTP为原料，沿此双链 DNA模板起始RNA的合成． SP6、T7、T3RNA聚合酶可用于合成单链 RNA以作为杂交用探针、体外翻译系统中的功 能性mRNA，体外剪接反应的底物；也可以直 接用于原核或真核细胞中克隆基因的表达。 某研究人员发现一种羽毛颜色较为奇特的鸟类，经前期研究发现这个改变可能与其中的一个控制色素生成的基因a有关，为了弄清基因a的突变与其表达的蛋白功能的变化，需要将此基因克隆并表达出来，正常鸟类的a基因已知且较大，请根据已学内容并设想可能出现的困难设计实验。 第六节 单链核酸内切酶 S1核酸酶 高度单链特异的核酸内切酶 功能：催化RNA和单链DNA分子降解成为5’单核苷酸，它也能作用于双链分子中的单链区，切断核酸分子 2. Bal31核酸酶 既具有单链特异的核酸内切酶活性，也具有双链特异的核酸外切酶活性。从5’和3’两端同时降解DNA 第七节 依赖于DNA的RNA聚合酶 依赖于DNA的RNA聚合酶 一、基因工程中常用的DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 2. Klenow fragment 3. T4 DNA聚合酶 4. T7 DNA聚合酶 5. 修饰过的T7 DNA聚合酶 6. Taq DNA聚合酶 7. 逆转录酶 1. 共同特点 把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。 2. 主要区别 T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。 其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。 持续合成能力和外切酶活性不同。 高 快 有 无 Taq DNA聚合酶 中 低 无 无 逆转录酶 高 快 无 低 化学修饰T7DNA聚合酶 高 快 无 高 T7 DNA聚合酶 低 中 无 高 T4 DNA聚合酶 低 中 无 低 Klenow fragment 低 中 有 低 大肠杆菌DNA聚合酶 I 持续能力 聚合速率 5’?3’外切酶活性 3’?5’外切酶活性 DNA聚合酶 1. DNA聚合酶I 在50年代的中期，A. Kornberg发现了DNA聚合酶Ⅰ（DNA polymerase Ⅰ，DNA pol Ⅰ）原来称为Kornberg酶。以后又相续发现了DNA pol Ⅱ和DNA pol Ⅲ。 DNA聚合酶的共同特点是： （1）需要提供合成模板； （2）不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3 －OH； （3）合成的方向都是5→3； （4）除聚合DNA外还有其它功能。 冈崎片段 1.DNA聚合酶I（polI） 三种酶催活性： 5’-3’ 聚合酶活性 5’-3’ 核酸外切酶活性 3’-5’ 核酸外切酶活性 polI催化合成DNA的三种条件： （1）存在四种dNTPs和Mg2+ （2）带有3’-OH游离基团的引物链 （3）DNA模板（双链或单链） 链合成方向：5’ 3’ polI的5’ 3’聚合作用 polI的5’ 3’核酸外切酶活性（切除修复） 必须是位于双螺旋的区段上；切割部位既可以是末端也可以是距末端数个核苷酸远的磷酸二酯键；伴随发生的DNA合成可以增强5’-3’外切酶的活性；对双链DNA的单链缺口有活性但要存在5’-P基团。 用枯草杆菌蛋白酶切割成两个片段，一个片段36kDa具有5’-3’外切酶的活性;另一片段76kDa具有聚合酶活性及3’-5’外切酶活性，此即为Klenow片段。 polI的3’ 5’ 核酸外切酶活性（校正） 从DNA链3’-OH末端开始水解DNA并释放单核苷酸分子，底物可以是双链的DNA也可以是单链的DNA。当反应物中缺乏dNTPs时，3’-5’外切酶活性将从3’-OH开始降解DNA。但在具有dNTPs的条件下，这种降解活性会被5’-3’的聚合酶活性所抑制。 DNA缺口转移，制备放射性标记的DNA探针 PolI、DNaseI、 32P