脑科ICU院内感染鲍曼不动杆菌分子分型和耐药机制研究.docVIP

脑科ICU院内感染鲍曼不动杆菌分子分型和耐药机制研究 　　摘 要 目的：分析脑科监护室院内感染的鲍曼不动杆菌的同源性，并研究其主要耐药机制。主要是A型克隆株，对头孢菌素和碳青烯类抗生素的耐药性主要是由于产OXA-23型碳青霉烯酶。? 　　关键词 院内感染 鲍曼不动杆菌 同源性 耐药机制? 　　 　　资料和法? 　　 　　病例和菌株来源：28株鲍曼不动杆菌系2004年4月～2005年10月由我院脑科监护室分离得到，均来自痰液标本。? 　　培养基：哥伦比亚血琼脂基础、MH琼脂、胰人豆蛋白胨肉汤均购自英国OXOID公司。抗生素：哌拉西林(PRL)、头孢他定(CAZ)、头孢噻肟(CTX)、哌拉西林／他唑巴坦(TZP)、头孢哌酮／舒巴坦(SCF)、亚胺培南(IPM)、美罗培南(MEM)、环丙沙星(CIP)、阿米卡星(AK)均购自中国抗生素研究所。? 　　试剂：PCR反应试剂购自上海申友生物技术有限责任公司，蛋白酶K、PMSF、Apal限制性内切酶、PFGE琼脂糖、低熔点琼脂均购自上海生工生物技术有限公司。? 　　仪器：DNA扩增仪为美国PE公司产晶；脉冲场凝胶电泳仪，美国Bio-Rad公司；VITEK1微生物自动鉴定及药敏系统为法国Biomerieux公司产品。? 　　随机鉴定卡：VITEK 1系统细菌鉴定卡为GNI+卡。? 　　方法：细菌的鉴定和药敏：细菌的鉴定采用全自动微生物鉴定和药敏系统VITEK1鉴定，操作参照说明书进行。琼脂释法药敏试验：参照CLSI规定检测抗生素对细菌的最小抑菌浓度(MIC)。脉冲场凝胶电泳(PFGE)：采用脉冲场凝胶电泳检测细菌的同源性。将细菌单个菌落接种于LB肉汤中，37℃200转／分，18～24小时，70001转/分离心2分钟，弃上清，用5×TE缓冲液 lml洗涤沉淀2次，离心弃上清，加TE缓冲掖，调整浊度到4个麦氏单位，取300μl与等量的2％低熔胶溶液迅速混匀，加入模块中，4℃20分钟。将胶吹入含800／ttg／ml的蛋白酶K中，50℃过夜，加TE缓冲液冲洗30分钟，再加PMSF酶终止液(174μg／ml)放置lh，用TE缓冲液洗涤2~3次，取半块胶用1×TE缓冲液120μl冲洗。4℃20分钟。用ApaI(50U)37℃酶切24小时，上电泳，电泳条件为：1％胶120度角，6V／cm，转换时间：0.22秒、18秒，电泳时间16小时。EB染色20分钟。? 　　结果判定：①酶切后图谱完全一致为同型。②酶切后图谱相比较有1~3条???不同，为亚型；③酶切后图谱相比较有3条以上条带不同者，定为另一基因型。? 　　 聚合酶链式反应检测耐药基因：根据参考文献报道的引物序列合成，引物序列用煮沸法进行模板DNA的提取，PCR反应体系为50μ，含1×PCR反应缓冲液，3．5mmol／L镁离子，2mmol／LdNTPs，50μmol／L引物，1．6Utaq酶，5μl模板。PCR反应条件根据不同的引物而决定，并将PCR产物直接测序，将测序结果在GenBank上对比。? 　　 　　结 果? 　　 　　药物敏感性：结果显示28株菌除一株对所有抗生素均表现为敏感外，其余27株菌均显示广泛耐药。? 　　 28株鲍曼不动杆菌对9种临床常用抗生素广泛耐药，不仅对广谱头孢菌素、喹诺酮类抗生素和氨基糖苷类抗生素具有较高的耐药性，而且对含酶抑制剂的复合抗生素也有较高的耐药性，耐药率达96.4 %。并且对碳青霉烯类抗生素也有较高的耐药率，其亚胺培南和美罗培南的耐药率均为96．4%。? 　　细菌同源性检测：脉冲场电泳检测28株鲍曼不动杆菌的同源性，脑科监护室分离到的主要是A型(20株)。耐药基因的检测：用OXA-23，IMP-1，VIM的引物扩增并测序。? 　　28株不动杆菌中没有检测到金属酶基因，而多数不动杆菌(85．7％)携带OXA．23型碳青霉烯酶基因。? 　　 　　讨 论? 　　 　　细菌耐药性监测对准确掌握耐药动向及指导临床合理用药具重要的意义。鲍曼不动杆菌目前已被认为是医院感染中重要的一种革兰阴性非发酵病原菌，其耐药性在逐年上升。近年来，随着广谱抗菌药物的广泛应用，鲍曼不动杆菌引起的感染急剧增多，多重耐药菌株迅速出现和日趋严重，且近年来出现了泛耐株，这些泛耐株几乎对所有临床常用抗菌药物都耐药。? 　　不动杆菌的耐药机制较为复杂，其对碳青烯类抗生素的耐药机制主要有：①产生水解碳青烯类抗生素的D类碳青霉烯酶和B类金属酶；②青霉素结合蛋白(PBPs)的改变；③外膜蛋白的改变和药物主动外排有关［3］。我们对28株不动杆菌检测了D类碳青霉烯酶OXA-23、B类金属酶IMP-1和VIM-2等耐药基因，结果显示24株(85．7%)不动杆菌携带OXA-23耐药基冈，这与我国不动杆菌流行碳青霉烯酶基