产生RNA干扰RANi的方法4产生RANi的方法产生RANi-中国试剂网.PDF

中国试剂网 3.14.2.17 产生RNA 干扰RANi 的方法 4 产生RANi 的方法 产生RANi 的方法主要有体外合成和体内合成siRNA 法。将siRNA 导入细胞的 方法又分为微量注射法、电穿孔法、浸泡法、工程菌喂养法、转基因法和病毒感 染法等。 Harborth 等[14]设计体外合成21ntsiRNA 的方法是：在基因库中寻找靶向基因 的mRNA 序列，并从起始密码后的第75 位碱基开始寻找AA+N19+UU 序列 或AA + N19 序列，其中N19 为任意19nt 的mRNA 核苷酸序列；然后设计选 定序列中的G+ C 的比例为30 % 70 %；对确定的序列用Blast 搜寻EST 基因 库，确定所靶向的基因是唯一模簧杓?1 个反义RNA 序列，并用SiACE2RNAi 方 法合成两条RNA 链，在其两链的3’末端最后2 个核苷酸设计合成dTdT 序列， 以减少细胞内降解。他们用体外合成的21 个核苷酸组成的 siRNA 分别转染人 和大鼠细胞株，作用于 NumA 等 16 个基因，使这些基因的表达均受到明显的 抑制。 1998 年，Fire[1] 等用微量注射法将体外合成的dsRNA 注射到线虫体内,观察到 dsRNA 可以从注射处的细胞扩散到体内其他细胞，并且RNAi 效应可以遗传至 下一代,在子代仍抑制靶向基因的表达。并且给幼虫喂食可表达双链 RNA 的细 菌，或将幼虫浸泡在含有dsRNA 的溶液中，也能观察到特异的突变表型。 由于RNA 易于被RNA 酶分解，而且不论是生物合成还是化学合成dsRNA，成 本均较高且费时，这在一定程度上限制了 RNAi 技术的应用。在细胞内合成 siRNA 诱导RNAi 的技术，大大削减了实验成本，增加了实验的可操作性。 Miyagishi[15]等建立了U6 启动子驱动的体内siR2NA 合成方法，成功地抑制了 靶基因在哺乳动物细胞中的表达。他们设计构建了两个U6 启动子分别引导19nt 的 siRNA 的正义链和反义链的合成，两段 RNA 在细胞内退火连接成为双链 RNA 。Sui 等也构建了U6 启动子控制的siRNA 表达质粒，不同的是siRNA 模 板为回文结构。在U6 启动子下游依次是siRNA 21nt 编码序列、6nt 的间隔序 列、反向的siRNA21nt 编码序列及由5 个T 寡核苷酸尾组成的转录终止序列。 这个质粒诱导合成的RNA 为发夹样双链结构。发夹样双链结构的RNA 比由正 中国试剂网 3.14.2.17 义链和反义链在细胞内退火后合成的 dsRNA 似乎更能有效地抑制靶基因的表 达。Brummelkamp[16 ]等构建了 pSU2PER 质粒载体,应用了聚合酶ⅢH12RNA 基因启动子起始 RNA 的合成。通过模板设计，使体内合成的 siRNA 呈发夹样 结构，并且能修饰3’端形成两个尿苷酸的突出结构，与化学合成的siRNA 结构 相类似。为了使RNAi 技术成为可以控制的诱导基因沉默的方法，Miyagishi 等 还建立了四环素调节的 U6 启动子系统,通过控制 U6 启动子就可以指令 RNAi 在特定的时间发生作用。并且经克隆筛选,拥有细胞内siRNA 表达系统的细胞株 可以长久保存并随时复苏使用。此外，一些在动物发育过程中起关键作用的基因， 如果在DNA 水平采用基因敲除或突变进行可遗传的修饰，则可能会过早地导致 基因沉默，产生致死表型，使研究无法继续进行。dsRNA 的表达受特异启动子 的控制，可以有目的地在特定的时间启动RNAi 。控制RNAi 在发育阶段开始 启动，可以研究发育早期的关键基因在发育后期的功能。 尽管质粒介导的RNAi 有上述众多优点， 但DNA 的转染多以瞬间表达为主， 最长也不过几天。并且在某些种类的细胞,转染率很低，即使在同种细胞中，转 染率也大不相同。为此，逆转录病毒和腺相关病毒[17，18]等也被用做载体。其 原理是类似的，都是携带启动子和DNA 模板，在细胞内指导合成siRNA 。所不 同的是病毒载体介导的siRNA 合成更快速、一致和稳定，即使在某些非分化、 原代培养的细胞中，转染率也能达到100%。 Eric 等先将指导发夹样结