第4章天然有机物分离纯化方法-1.pptVIP

第4章 天然有机物分离纯化方法 教学目的 1.熟悉天然有机物分离纯化常用方法。 2.掌握各类常用分离纯化方法的原理。 3.了解各类常用分离纯化方法的操作方法。 4.掌握各类常用分离纯化方法适用范围。 本章内容 第一节 沉淀分离法 通过提取的过程，把天然有机化合物从生物材料中提取出来了。虽然从某种意义讲，它存在于生物材料中的有效成份被提取、浓缩于一起。但它仍是各种化合物的混合物，还必须据科研、生产的需要，采取一定手段（操作技术）将杂质除去的同时把各个有效组份尽可能予以分离纯化。 这些分离纯化工作主要包括： ① 沉淀法； ② 色谱法； ③ 溶剂萃取法； ④ 结晶法等等。 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。 1. 沉淀分离法基本原理 沉淀法也称溶解度法。其纯化生命大分子物质的基本原理是根据各种物质的结构差异性（如蛋白质分子表面疏水基团和亲水基团之间比例的差异性）来改变溶液的某些性质（如pH、极性、离子强度、金属离子等），进而导致有效成分的溶解度发生变化。换句话说就是，不同的物质置入同一溶液中，溶解度是不同的；相同的物质置入不同的溶液中，溶解度也是不同的。 因此，选择适当的溶剂就能使欲分离的有效成分呈现最大溶解度，而使杂质呈现最小溶解度，或者相反。如此操作，就能达到用沉淀法分离有效成分的目的。 2. 沉淀分离法的用途 沉淀分离法在生物化学、有机化学和无机化学制备工艺中，沉淀法都是一种最常用的方法。 3. 在生化制备中常有下列几种沉淀方法： （1）盐析法：多用于各种蛋白质和酶、核酸、多肽、多糖等的分离纯化。 （2）有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸类产品的分离纯化，有时也同于蛋白质沉淀。 （3）等电点沉淀法。用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。 （4）非离子多聚体沉淀法：最近使用于分离生物大分子的例子很多；是发展很快的一种方法。 （5）生成盐复合物沉淀。用于多种化合物，特别是一些小分子物质的沉淀。 （6）热变性及酸碱变性沉淀法：这一类方法也常称为选择性变性沉淀。 在分离制备中，常有选择地用于除去某些不耐热及在一定pH 值下身变性的杂蛋白。但应以在实验条件下所分离物质的活性不受影响为前提。 （7）其他：除以上所述沉淀方法外。只对某一种或某一类物质产生沉淀的沉淀方法及沉淀剂。 下面介绍几种主要沉淀方法的原理及其操作方法。 一、盐析法 （一） 盐析法的原理 根据是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出（盐析）。 （二）盐析法的一般操作步骤： 选择一定浓度范围的盐溶液（如 0～25%饱和度硫酸铵），使部分杂质呈“盐析”（沉淀）状态，有效成分呈“盐溶”（溶解）状态。经离心分离后得上清液，再选择一定浓度范围的盐溶液（如 25～60%饱和度的盐溶液），使有效成分等物质呈盐析状态，而另一部分杂质呈盐溶状态，用离心法收集的沉淀物即为初步纯化的有效成分物质。这也是蛋白质进行分级沉淀时常用的操作步骤。 盐析法的优点： a . 成本低，不需要什么特别昂贵的设备。 b. 操作简单，安全。 c. 对许多生物活性物质具有稳定作用。 盐析法的缺点：盐析法由于共沉作用，不是一个高分辨的方法 。宜于初提纯阶段和与其他方法交替使用。 （三）盐的分级沉淀 1. 盐类的选择 一般进行蛋白质沉淀时，常选用的中性盐是硫酸铵。因为硫酸铵与其它中性盐（如NaCl、K2SO4、、Na2SO4、MgSO4、Na3PO4、K3PO4、KCl、CH3COONa、KSCN、等）相比，有以下