刚果红与牛血清蛋白相互作用的荧光光谱研究.pptVIP

刚果红与牛血清蛋白相互作用的荧光光谱研究 01应用化学： 翟 萌 指导老师： 吴 霞 前言 蛋白质作为生命活动的物质基础，其定量分析在生物学 ，医学及其营养科学等领域中具有重要意义。蛋白质含量的分析方法很多，目前应用最广，操作较为简便的分子光谱分析方法有吸光光度法，荧光光谱法以及新近发展的共振光散射分析法。 荧光光谱法是研究生物大分子, 特别是蛋白质与各种有机小分子、离子和无机化合物相互作用的重要手段。通过对荧光特征峰及其在不同条件下的位移情况、荧光偏振、同步荧光、能量转移效率、荧光寿命、荧光猝灭、荧光增强等的研究, 可以获得蛋白质分子中荧光生色基团的种类、结构和所处微环境及其分布情况等有用信息, 同时还可以得到外源物质与生物大分子相互作用的有关数据。 本文通过荧光光谱技术，研究刚果红与牛血清蛋白（BSA）在表面活性剂TX-100存在下的相互作用，探讨刚果红与BSA作用的机制，测定其荧光猝灭常数、刚果红与BSA作用的结合常数和结合力。 刚果红在非离子表面活性剂TX-100存在下对BSA荧光猝灭的作用 移取3.00mL1.0×104g·mL-1的BSA于3.5mL石英比色池中，用微量注射器（范围：1~10μL）逐次加入1μL的CR-TX-100混合溶液进行荧光滴定，每次加入溶液后混合均匀，分别在室温(16℃)和恒温37℃下作用20min，以279nm为激发波长，在荧光分光光度计上记录300-450nm波长范围内的发射光谱。 若将CR-TX-100混合溶液对BSA荧光的猝灭归因于分子碰撞引起的动态猝灭, 按照Stern-Volmer方程: F0/F =1+Kqτ0 [CR] = 1+Ksv[CR] Ksv = Kqτ0。由于CR-TX-100混合溶液的累积体积为10μL , 占BSA溶液体积的0.3%，所以可忽略滴定过程中的体积变化。以F0/F 对[CR ]绘图, 得到右图 在静态猝灭中，静态猝灭荧光强度与猝灭剂的关系有： （F0-F）-1=F0-1+ F0-1K-1[CR]-1。 以（F0-F）-1对[CR]-1绘图，得到右图 当温度变化不大时，反应焓变ΔH可以看作是一个常数， 由㏑(K2/K1)= ΔH/R(1/T1-1/T2);ΔG=ΔH-TΔS; ΔG=-RT㏑K; 可以求出反应焓变ΔH为-59.7kJ/mol; 熵变ΔS为-83.0J/(mol·K)，即ΔH﹤0, ΔS﹤0 。 生理条件下刚果红在TX-100存在下对BSA的荧光猝灭 在10mL比色管中依次加入1.00mL1.0×10-3g·mL-1的BSA，1.00mL9%的NaCl溶液，1.00mLpH=7.40的Tris-HCl缓冲溶液，用水稀释至10mL，摇匀，分别在室温和恒温37摄氏度下，取该溶液3.00mL放于3.5mL石英比色池中,用微量注射器依次加入1μL的CR-TX-100混合溶液(CR:TX-100=1:25,CR=1.6×10-4 mol·L-1),每次加入溶液后混合均匀，以279nm为激发波长，在荧光分光光度计上记录300-450nm波长范围内的发射光谱。 由㏑(K2/K1)=ΔH/R(1/T1-1/T2); ΔG=ΔH-TΔS; ΔG=-RT㏑K可求出ΔH=3.2 kJ/mol, ΔS=133.4 J/(mol·K), ΔH﹥0, ΔS﹥0，由热力学参数与结合力的关系，我们可以推断在生理条件下，刚果红与BSA结合的作用力类型主要是疏水作用力。 pH=2.75的柠檬酸钠-盐酸缓冲溶液中刚果红在TX-100存在下对不同浓度BSA的荧光猝灭 在10mL比色管中，分别加入0﹑20μL﹑40μL﹑60μL﹑80μL﹑100μLCR-TX-100混合溶液，再加入1.00ml pH=2.75的柠檬酸钠-盐酸缓冲溶液,分别加入1.00mL的BSA(1×10-4g·mL-1)和1.00mL的BSA(1×10-3g·mL-1)，以蒸馏水稀释至刻度，震荡摇匀，放置20min。以279nm为激发波长，在荧光分光光度计上记录300-350nm波长范围内的发射光谱。 图7CR-TX-100与 不同浓度BSA的Stern-Volmer图 由上表可以看出，当BSA的浓度升高时，CR-TX-100与BSA的猝灭速率常数降低。 高浓度时不同温度CR-TX-100与BSA的Lineweaver-Burk图 由Lineweaver-Burk图可求出BSA浓度为1×10-4g·mL-1 37℃时的结合常数为3.9×105 L·mol-1，由热力学公式可以求出. ΔH﹤0, ΔS﹥0,根据热力学参数与作用力的关系，可知pH=2.75的柠檬酸钠-盐酸缓冲溶液中刚果红在TX-100存在下与BSA结合的作用力类型主要是静电引力。 同