s100-rage轴与冠心病的临床和基础研究-clinical and basic research on s100 - rage axis and coronary heart disease.docxVIP

S100P ELISA KitMBL International Corporation, Woburn, MACRP ELISA KitRD systems, Minneapolis, MNTNFαELISA KitRD systems, Minneapolis, MN2.2 主要仪器设备仪器设备公司Multiskan Ascent 96 孔板全自动酶标仪Thermo，美国5810R 低温离心机Eppendorf，德国Hitachi 912 分析仪Roche Diagnostics，瑞士MM-2 型水平微量振荡器华利达，上海Hewlett-Packard Sonos 2500Hewlett-Packard，美国GE Vivid-7 systemGeneral Electric Vingmed Sound AS，挪威3. 研究对象均为 2007 年 10 月至 2009 年 3 月在我院心内科接受冠状动脉造影的 882 例连续 性病人。详细询问及记录病史、既往史、家族史、吸烟史及胰岛素、胰岛素增敏剂、 降压药、他汀类药物等用药情况。为了避免心力衰竭对血清 S100 蛋白水平的影响， 排除先前有心肌梗死史的患者，同时剔除标准还包括：脑卒中史、恶性肿瘤性疾病、 结缔组织病、心脏瓣膜性疾病、原发性心肌病、严重心衰、急慢性感染和重度肾功 能不全。基于相关的诊断标准，将研究对象分为三组：第一组 (251 人，正常对照组，冠 脉内腔狭窄≤30%)，第二组（211 人，稳定型心绞痛组），第三组（420 人，急性冠 脉综合征组）。其中急性冠脉综合征（ACS）组包括 70 例不稳定型心绞痛组（UA）和 90 例非 ST 段抬高型心梗（NSTEMI）和 260 例 ST 段抬高型心梗(STEMI)。稳定型心绞 痛的患者根据冠脉病变支数又分为单支、双支和三支病变等亚组。4. 方法4.1 冠状动脉造影及定量分析冠脉造影和介入治疗通过股动脉或桡动脉，标准 Judkins 法,且冠脉内注射 100ug 硝酸甘油防止冠脉痉挛。造影结果分析由两名经验丰富的从事介入诊治工作 的医师完成。如果主要冠脉（包括左主干、前降支、回旋支、右冠脉）管腔狭窄大 于或等于 50%的诊断为冠心病，左主干狭窄大于或等于 50%算作双支血管病变。 4.2 生化指标测定急性冠脉综合征患者收集症状发生后 24 小时内急性期的血清，其他患者均采集 禁食 8h 以上清晨空腹血。以 3000 转/分离心 10min,分离上层血清并-70℃冰箱保存。 临床生化指标检测包括血脂全套、血糖、糖化血红蛋白等，所有检测均由我院生化 室完成，其中总胆固醇和甘油三酯用酶法测定，HDL-C、LDL-C 用磷钨酸镁沉淀法， Apo-A 和 Apo-B 用免疫浊度法，脂蛋白（a）用酶联免疫吸附法测定。急性心梗患者 心梗后心肌酶谱的动态变化也做了具体的检测和记录，包括肌酸激酶、肌红蛋白、 肌酸激酶同工酶（CK-MB)及肌钙蛋白(cTnI)。4.3 血清 S100B 测定采用人 S100B ELISA 试剂盒（BioVendor, Czech Republic），其检测范围是 51.65-2000 pg/ml，批间和批内变异系数分别是 3.2% 和 7.8%。检测步骤简述如下：4.3.1 试剂的准备试剂盒内主要试剂英文名抗体包被的 96 孔板Antibody Coated Microtiter Strips 生物素标记抗体浓缩液(100×)Biotin Labelled Antibody Conc. (100x) 抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶偶联剂Streptavidin-HRP Conjugate 标准品（粉剂）Master Standard质控高管Quality Control HIGH质控低管Quality Control LOW生物素标记抗体稀释液Biotin-Ab Diluent稀释缓冲液Dilution Buffer洗脱浓缩液（10×）Wash Solution Conc. (10x)底物溶液Substrate Solution终止液Stop Solution1) 1×洗脱工作液：用双蒸水将 10×的洗脱浓缩液稀释成 1×洗脱工作液，如 10 uL10×洗脱浓缩液+90 ul 双蒸水稀释，它主要用于浸洗微孔板，稀释好的工作液 4℃保存。2) 1×生物素标记抗体工作液：试剂盒提供 100×生物素标记抗体浓缩液 0.15mL， 使用前用生物素标记抗体稀释液稀释成工作液。如 10 uL 100×生物素标记抗体 浓缩液+990 uL 生物素标记抗体稀释液稀释。3) 标准液的制备:取粉剂标准品，先离心，使吸附在管盖和管壁上的粉末沉于管底， 小心开盖避免粉末撒出。在标准品管中加入 1000 ul 稀释缓冲液，摇