sox9与ⅱ型胶原在小鼠mscs三系分化中的实验分析-experimental analysis of sox 9 and collagen ⅱ in differentiation of mouse mscs in three lines.docxVIP

SOX9 与Ⅱ型胶原在小鼠 MSCs 三系分化中的实验研究中文摘要目的：通过成骨、成软骨、成脂肪诱导干细胞分化，分析三种分化过程以及不同时期 的 SOX9 与Ⅱ型胶原 mRNA 含量的变化，探讨 SOX9 在不同时空分布的表达规律及与Ⅱ型胶 原的相关关系。方法：取 4 周龄昆明小鼠骨髓间充质细胞，体外培养得到 MSCs 并传达至第 3 代，对 所获取的细胞进行流式细胞仪鉴定细胞表型确定为干细胞，通过流式细胞仪对干细胞进行 细胞周期检测确定细胞增殖能力属于正常范围确定细胞数量，共分三组每组设三个时间 段，不进行诱导的细胞作为对照组。通过成骨、成软骨、成脂肪三种诱导培养液对三组细 胞进行诱导，分别在 3 天、7 天、14 天后收集提取细胞的总 RNA，通过 RT-PCR 进行 SOX9 与Ⅱ型胶原的 mRNA 定量检测，同时对诱导后的细胞进行染色、免疫荧光染色，观察其分 化状态及相关统计分析。结果：第三代 BMSCs 生长良好，流式细胞仪鉴定细胞表型证实为干细胞，对诱导后细 胞进行染色、免疫荧光染色结果证实细胞分化为骨、软骨、脂肪细胞；经 RT-PCR 检测， 在三组诱导分化细胞中 SOX9 mRNA 含量由高到低分别是成软骨、成骨、成脂肪，Ⅱ型胶原 mRNA 含量由高到低分别是成软骨、成脂肪、成骨。在成软骨分化中 SOX9 在 3 天、7 天是 不断升高的，14 天呈下降趋势。Ⅱ型胶原在 3 天、7 天、14 天都是逐渐升高的。在成骨分 化中 SOX9 mRNA 含量随着时间推移而增加，而Ⅱ型胶原则随着时间推移而不断降低，两组 及各时间点表达含量相比较具有统计学意义（P0.05）。在成脂肪分化中 SOX9 mRNA 表达 与对照组比较没有统计学差异（p0.05）；而Ⅱ型胶原的表达没有规律可循，时间点的延 伸及检测未观察到。结论：提示 SOX9 在软骨分化中作用优于成骨、成脂肪组，且软骨分化中 SOX9 与Ⅱ型胶原存在相关性，可能在软骨分化的早期Ⅱ型胶原随着 SOX9 的变化而变化；软骨分化和成骨分化过程中 SOX9 与Ⅱ型胶原都有表达，软骨分化中两者表达逐渐增加、成骨分化中两者表达逐渐减少关键词：SOX9 ； 三系分化；mRNA 定量； II 型胶原The experimental study of SOX9 and Type Ⅱ collagen in theprocess of three lineages of differentiation of MSCsAbstractObjucive To Observe the Variation and relevant contact of SOX9 and Type Ⅱ collagen by BMSCs in three lineages of differentiation and Analysis the change both of mRNAcontent.Methods Mouse bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and purified by adhesion method. After subculturing and proliferation, expression of cell surface moleculeCD14 、 CD34 、 CD105 was detected by flow cytometry. Cell cycle was detected by flowcytometry to ensure normal cell proliferation. Three groups and three time periods were observed ,not induced cells were used as a control group.The multilineage differentiation capability of bone marrow mesenchymal stem cells was examined by culturing cells underconditions favorable for adipogenic 、 chondrogenic and osteogenic differentiation in threedifferent time periods. The expression of target gene was detected by immunofluoresecence, RT-PCR and Western blot.Results The MSCs exhi