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基于石墨烯化学修饰电极适体传感器 　　摘 要 采用石墨烯（RGO）作载体，凝血酶适体（TBA）作探针，凝血酶为目标蛋白，电化学阻抗谱（EIS）为检测技术，建立了检测蛋白质的新方法。由于RGO可增大电极有效表面积并提高电极表面电子传输速率以及TBA的特异性识别能力，此方法具有较高的灵敏度和良好的选择性。采用本方法检测凝血酶的线性范围为?0.3～10 fmol/L，检出限为0.26 fmol/L。本研究将RGO应用于电化学适体传感器，证实了RGO修饰电极在电化学适体传感器领域中潜在的应用价值。 　　关键词 石墨烯； 适体传感器； 电化学阻抗谱； 凝血酶 　　 2011-07-16收稿；2011-09-24接受 　　本文系国家自然科学基金（No和江苏高校优势学科建设工程资助项目 　　* E-mail: yangxiaodi@njnu.省略; yhxiao@njnu.省略 　　1 引 言 　　?Symbol`@@ 　　蛋白质生物分子是组成和维持生命活动的重要物质，因此这类物质的分析检测具有重大意义。生物传感器是简单、快速检测生物分子的重要工具，如免疫检测中的抗体在检测蛋白质的生物传感器中广泛应用。随着体外人工进化程序的出现，提供了能分离识别各种各样目标分子的核酸适体。与抗体相比较，适体具有高特异性、高亲和力、分子量小、与目标分子结合空间位阻小、可重复利用和稳定性良好等优点。适体不仅可以与酶、生长因子等较大的蛋白质分子结合，而且也可以与金属离子、氨基酸等小分子物质结合，甚至可以与完整的病毒颗粒、细菌和细胞等结合[1～5]，在治疗与诊断方面成为与抗体竞争的对手。在适体众多的目标待测物中，蛋白质的研究是一个热点。 　　石墨烯（RGO）是单层碳原子紧密排列的二维纳米材料，其特殊的二维结构，使其除具有纳米效应外，还具有完美的量子隧道效应、半整数的量子霍尔效应和从不消失的电导率[6]等一系列优异性质；其内部电子运动速率可达光速的1/300[7]，修饰于电极表面可有效促进电子转移[8]，以上这些性质使RGO成为电化学生物传感器的理想材料。目前RGO可用于检测NO?2[9]、多巴胺[10]、葡萄糖[11]、蛋白质[12,13]、细胞色素[14]。以光学为检测信号的RGO适体传感器已有报道[15,16]，但将RGO应用于电化学适体传感器的研究鲜有报道。 　　本研究将RGO通过一定的方法修饰于电极表面，以高特异性分子识别物质凝血酶适体（TBA）作为探针，凝血酶为目标蛋白，利用高灵敏性的电化学阻抗谱（EIS），建立了检测蛋白质的新方法。将氧化石墨烯（GO）固定在玻碳电极（GCE）表面，利用还原反应获得RGO修饰电极。进一步通过π -π堆积作用，或利用碳二亚胺反应[17]结合TBA。当TBA与环境中凝血酶结合时会形成四聚体-凝血酶复合物，导致修饰电极表面交流阻抗值发生变化。本研究以氧化还原指示剂[Fe（CN）?6/Fe（CN）?6]3 　　?Symbolm@@ /4 　　?Symbolm@@ 在电极/电解液界面电子转移电阻（R??et）发生变化作为检测信号，将RGO应用于电化学适体传感器，为蛋白疾病的诊断和临床治疗提供具有应用价值的分析方法与技术。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　CHI660B电化学工作站（上海Chenhua公司）； 2100型透射电子显微镜（日本电子公司）； 数显恒温水浴锅（常州Guahua公司）； 傅里叶变换红外光谱仪（美国Varian公司）。 　　TBA为5′-NH?2-GGT TGG TGT GGT TGG-3′，由上海柏业贸易有限公司合成；GO为实验室自行合成；人体α-凝血酶（Sigma公司）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）购自Sigma-Aldrich公司；牛血清白蛋白（BSA）和胰蛋白酶（TYP）购自上海瑞鼎化学技术有限公司；其它化学试剂均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水（18.25 MΩ#8226;cm）。 　　2.2 实验方法 　　2.2.1 GO电极的制备 GCE依次用0.3 和0.05 μm的α-A1?2O3抛光至呈镜面，依次用水和无水乙醇清洗、超声2 min，最后用水冲洗干净，室温下干燥。将2 μL壳聚糖（CS）和GO混合溶液（1∶4，V/V, 0.6 g/L GO）滴涂在GCE表面，室温干燥6 h，得GO电极。 　　2.2.2 RGO电极的制备 GO修饰电极浸于85%的水合肼中，在恒温60 ℃下加热6 h，停止加热后，继续浸泡18 h，取出电极后依次用水、0.1 mol/L 磷酸盐缓冲溶液（PBS）冲洗干净，得RGO电极。 　　2.2.3 TBA在 RGO电极上的固定 　　将RGO