蛋白质复性的条件及影响因素_cropped.docVIP

 摘要 蛋白质复性是一个过程 ,存在中间阶段 ,此阶段的各种相互作用力决定了蛋白质能否复性 。蛋白质复 性要求有一定的条件 ,如 p H、温度 、离子强度 、蛋白质浓度等 。另外多种添加剂能促进蛋白质复性 ,其中包括表面 活性剂 、低浓度变性剂 、分子伴侣蛋白和各种氧化还原对 ,但对于不同蛋白质 ,因其结构及理化特性不同 ,采取不同 复性方法 ,可以使其达到最佳复性效果 。 关键词 蛋白质 ; 结构与复性 蛋白质是一种具有复杂的空间立体结构的大分 子物质 ,易受外界条件的影响发生变性 。随着基因 工程技术的发展 ,许多实验通过将目的蛋白基因转 入原核或真核表达体系进行表达的方法 ,得到需要 的蛋白质 ,这大大丰富了蛋白质的来源 。但这些蛋 白质 ,由于表达体 系 本 身 的 原 因 , 或 实 验 过 程 的 处 理 ,多以无活性的形式存在 ,需要进行复性 。因此 , 对蛋白质复性的研究必然的成为从基础的实验室生 物工程研究到最终临床应用过 程 中 不 可 避 免 的 一 步 。本文将目前国内外对各种蛋白质复性方面的研 究作一综述 。 结构 ,某些脯氨酸异构酶在含有脯氨酸的变性蛋白 质中被证明对复性有辅助作用 。来源于不同物种中 的同一蛋白质在氨基酸排列顺序上会存在不同程度 的差 异 , 但 其 折 叠 方 式 却 有 很 大 的 保 守 性 。Wal2 lace 3 研究了来源于大肠杆菌 、人和乳酸杆菌的二氢 叶酸还原酶的复性 ,虽然这 3 种蛋白在氨基酸顺序 上只有 30 %相同 ,但是却具有相同的复性途径和两 个中间体 。蛋白质的空间结构由一系列化学键来维 系 ,其中二硫键是维系蛋白质结构完整的重要共价 键 ,二硫键的打开或错误搭配会引起蛋白质高级结 构的丧失 ,恢复二硫键结构是蛋白质复性的重要一 步 。在蛋白质的复性过程中 ,存在一系列的结构相 1 蛋白质的结构与复性 蛋白质在一定的氨基酸顺序的基础上形成非常 复杂的空间立体结构 ,其组成中的氨基酸本身的特 性是蛋白质高级结构形成的决定因素和结构基础 , 尤其是处于关键部位的氨基酸 ,对蛋白质的生物学 功能有根本的影响 ,例如镰刀型红细胞贫血症中血 红蛋白氨基酸的变化 。因此 ,能达到复性的蛋白质 变性应是在保持氨基酸的基本种类和顺序不变的基 础上 ,由于其他因素的影响而引起的分子高级结构 的变化 ,如α2螺旋 、β2折叠结构的增减 , 肽链的变性 舒展 ,杂乱结构的增多 ,从而使蛋白质正常的生物学 活性丧失 。蛋白质稳定性与组成中的氨基酸种类有 关系 ,例如含有巯 基 的 氨 基 酸 , 最 常 见 的 是 半 胱 氨 酸 ,会降低蛋白质在高温条件下的稳定性 ,尤其在某 些金属离子 , Cu + 、Zn2 + 等存在时 , 蛋白质对空气中 的氧更为敏感 , 而易发生不可逆变性1 , 在此基础 上 ,有人通过用丝氨酸 、丙氨酸替换活跃的半胱氨酸 的方法来提高蛋白质的稳定性2 ,这当然要在不影 响蛋白质的生物学活性的基础上才有意义 。脯氨酸 本身存在顺反两种异构形式 ,也会影响蛋白质空间 似的中间体 ,这些中间体分子表面有许多疏水基团 暴露 ,对聚集较敏感 ,易于形成沉淀 。同时 ,分子内 部氨基酸之间存在使蛋白质正 确 折 叠 的 天 然 作 用 力 ,蛋白质的复性过程就是这些中间体向两个方向 选择性的演变过程4 ,蛋白质复性效率就取决于正 确折叠和变性聚集之间的竞争 。疏水链暴露后 ,肽 链上某些具有光吸收作用的氨 基 酸 也 暴 露 于 溶 液 中 ,会引起蛋白质紫外吸收值发生一定的变化 ,根据 这一点 ,可以对变复性过程中蛋白质的结构情况进 行观察 。蛋白质的变性过程发生是比较迅速的 ,只 要几分钟 ,但复性过程却相对较慢 ,需要几个小时 , 因此 ,复性时要给予足够的时间 。 2 蛋白质复性条件 蛋白质的复性对环境中的理化条件有很高的要 求 ,复性时必须对温度 、p H 、离子强度等进行严格的 限制 ,同时蛋白质本身的性状也对复性效率产生影 响 。朱慧等5 在研究重组人前尿激酶复性时 ,对不 同复性条件进行实验比较 ,发现强酸强碱均不利于 蛋白质复性 ,偏碱 (p H8 . 6～8 . 8) 、低温 ( 4 ℃) 情况下 Hevehan11 的研 究 表 明 , 这 一 比 例 关 系 需 随 蛋 白 质 浓度作调整 ,实验中还原型和氧化型巯基试剂比例 介于 3 ∶1～1 ∶1 之间时 ,蛋白质达到最大复性 。空 气中的氧是很好的二硫键催化剂 ,Menzella 等12 的 研究成功地利用空气中的氧使 前 凝 乳 酶 原 达 到 复 性 ,复性中需要监测溶液 p H 值 ,而且适量加入精氨 酸和中性表