连接反应的影响因素提高平端连接效率的方法.docxVIP

DNA连接反应的影响因素提高平端连接效率的方法外源ＤＮＡ和质粒载体的连接反应平端ＤＮＡ连接接反应1、连接缓冲液的影响：大体上缓冲液含有以下组分：20-100mmol/L的Tris-HCl，较多用50mmol/L，pH的范围在7.4-7.8，较多用7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应；1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L，作用是维持还原性环境，稳定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。与限制酶缓冲液不同的是连接酶缓冲液还含有0.5-4mmol/L的ATP，现多用1mmol/L，是酶反应所必需的。2、 pH的影响：一般将缓冲液的pH调节到7.4-7.8，较多用7.8。有实验表明，若把pH为7.5-8.0时的酶活力定为100%，那么体系偏碱（pH为8.3）时仅为全部活力的65%；当体系偏酸（PH为6.9）时仅为全部活力的40%。3、 ATP浓度的影响：连接缓冲液中ATP的浓度在0.5-4mmol/L之间，较多用1mmol/L。研究发现，ATP的最适浓度为0.5-1mmol /L，过浓会抑制反应。例如，5mmol/L的ATP会完全抑制平末端连接，黏端的连接也有10%被抑制；还有报道，当ATP的浓度为0.1mmol/L 时，去磷酸载体的自环比例最大。由于ATP极易分解，所以当连接反应失败时，除了DNA与酶的问题外，还应考虑ATP的因素。含有ATP的缓冲液应于 -20℃保存，溶化取用后立即放回。连接缓冲液体积较大时最好分小管贮存，防止反复冻融引起ATP分解。与限制酶缓冲液不同的是，含ATP的连接缓冲液长期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的缓冲液（可长期保存），临用时加入新配制的ATP母液。4、连接温度与时间的影响：因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，但连接酶的最适温度又恰为37℃。为了解决这一矛盾，在经过综合考虑后，传统上将连接温度定为16℃，时间为4-16h。现经实验发现，对于一般的黏性末端来说，20℃ 30min就足以取得相当好的连接效果，当然如果时间充裕的话，20℃ 60min能使连接反应进行得更完全一些。对于平末端是不用考虑氢键问题的，可使用较高的温度，使酶活力得到更好的发挥。5、酶浓度的影响：日常使用的DNA浓度比酶单位定义状态低10-20倍，连接平末端时酶用量要比连接黏端大10-100倍。进行黏末端连接时需先行稀释，稀释液的成分与酶保存缓冲液相同或类似，稀释液中的酶能在长时间保持活力，也便于随时取用。6、 DNA浓度的影响：要求得到环化的有效连接产物， DNA浓度不可过高，一般不会超过20nmol/L。要求线性化的连接产物， DNA的浓度可以高些，至少是接近推荐的浓度。在用大质粒载体进行大片段克隆时，以及在双酶切片段的连接反应中，DNA浓度还应降低，甚至是DNA的总浓度低至几个nmol/L。另据研究，T4 DNA连接酶对DNA末端的表观Km值为1.5nmol/L，所以，连接时DNA浓度不应低于1nmol/L。即应具有2nmol/L的末端浓度。提高平端连接效率的方法：1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好，平端连接需要过夜反应。2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。足够多的载体和插入片段是最重要的。要看片段具体情况而言，有时载体和片段浓度过高，容易产生线性化产物，不利于环化的。插入的DNA片段的摩尔数是载体摩尔数的5-10倍，这个很关键。载体通常50ng就够了，若载体在10k左右，可用50－100ng。3、平端的连接对于离子浓度很敏感，回收的时候多洗洗，加PEG和扩大酶量，22度2小时后4C过夜。4、尽可能缩小连接反应的体积，最好不超过10微升，在5、6微升左右最佳。5、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好。（一）外源ＤＮＡ和质粒载体的连接反应　　外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５磷酸和相邻的3羟基之间形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入后可被修复。相邻的５磷酸和３羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌ＤＮＡ连接酶和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶。实际上在有用途中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶都是首选的用酶。这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。　　ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决