作物遗传育种专业优秀论文 基因枪介导bt基因转化能源甘蔗的研究.docVIP

作物遗传育种专业优秀论文 基因枪介导BT基因转化能源甘蔗的研究 关键词：基因枪 能源甘蔗 基因转化 生物产量 育种群体 遗传背景 苏云金芽孢杆菌 摘要：甘蔗(Saccharum officenarum L.)以高生物产量、高乙醇产率和低生产成本的优势，入选能源植物，特别是新台糖22号，含糖量高、分孽快、抗逆性强、适应性广，成为能源甘蔗的首选。而甘蔗虫害造成甘蔗大量减产，用传统的耕作措施和化学药剂等方法还没能有效地起到防治的作用，因此，培育抗性品种成为防治甘蔗虫害最经济、安全和有效的根本方法。但是，甘蔗是一种具有高度杂合性的异源多倍体或非整倍体的无性繁殖作物，其遗传背景十分复杂，育种群体分离十分广泛，这使得通过常规的育种手段很难将各种优良的目标性状整合为一体。 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)杀虫晶体蛋白基因，应用于抗虫植物基因工程的研究日臻成熟，而基因枪介导法又为那些对农杆菌侵染不敏感的单子叶植物提供了一个有效的转化手段。 本研究采用基因枪转化法，首先选择适龄期新台糖22号的胚性愈伤组织作为转化受体；轰击前经过预培养和高渗培养，在优化的真空度、轰击压力、轰击距离下进行遗传转化；然后将携带Bt基因的质粒pBAR-BT转入愈伤组织，轰击后的愈伤组织在高渗培养基上继续培养一段时间后，转入恢复培养基进行恢复培养，接着进行继代、分化、生根阶段的筛选培养，最后利用PCR、RT—PCR和Elisa方法进行分子检测，获得抗性转基因甘蔗植株。 主要研究结果如下： 1)对新台糖22号的再生体系进行了优化。采用正交设计法，研究了激素6-BA，NAA，KT和活性炭这四种因素的不同浓度和不同组合对甘蔗愈伤组织分化的影响，试验研究结果表明，对新台糖22号的愈伤组织分化效果最佳的培养基为A183C3D3，即MS+1.5 mg/L6-BA+2mg/L KT+0.25mg/L NAA+1.0g/L活性炭+30 g/L蔗糖+5g/L琼脂粉。 2)建立了新台糖22号的筛选体系。Phosphiothricin(PPT)对甘蔗愈伤组织的生长、分化、分化苗的继代、生根和生长阶段的抗性筛选质量浓度分别为1.5 mg/L、1mg/t，、0.75 mg/L、0.5 mg/L、30mg/L。 3)受基因枪轰击的愈伤组织，在含有PPT的培养基上进行筛选，从轰击的三批共约500个愈伤组织块中，第一批共分化出100株抗性转化幼苗，其中PCR检测呈双阳性的植株有39株，最后经RT-PCR和Elisa检测后，共得到5株高表达的新台糖22号甘蔗植株。 正文内容 甘蔗(Saccharum officenarum L.)以高生物产量、高乙醇产率和低生产成本的优势，入选能源植物，特别是新台糖22号，含糖量高、分孽快、抗逆性强、适应性广，成为能源甘蔗的首选。而甘蔗虫害造成甘蔗大量减产，用传统的耕作措施和化学药剂等方法还没能有效地起到防治的作用，因此，培育抗性品种成为防治甘蔗虫害最经济、安全和有效的根本方法。但是，甘蔗是一种具有高度杂合性的异源多倍体或非整倍体的无性繁殖作物，其遗传背景十分复杂，育种群体分离十分广泛，这使得通过常规的育种手段很难将各种优良的目标性状整合为一体。 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)杀虫晶体蛋白基因，应用于抗虫植物基因工程的研究日臻成熟，而基因枪介导法又为那些对农杆菌侵染不敏感的单子叶植物提供了一个有效的转化手段。 本研究采用基因枪转化法，首先选择适龄期新台糖22号的胚性愈伤组织作为转化受体；轰击前经过预培养和高渗培养，在优化的真空度、轰击压力、轰击距离下进行遗传转化；然后将携带Bt基因的质粒pBAR-BT转入愈伤组织，轰击后的愈伤组织在高渗培养基上继续培养一段时间后，转入恢复培养基进行恢复培养，接着进行继代、分化、生根阶段的筛选培养，最后利用PCR、RT—PCR和Elisa方法进行分子检测，获得抗性转基因甘蔗植株。 主要研究结果如下： 1)对新台糖22号的再生体系进行了优化。采用正交设计法，研究了激素6-BA，NAA，KT和活性炭这四种因素的不同浓度和不同组合对甘蔗愈伤组织分化的影响，试验研究结果表明，对新台糖22号的愈伤组织分化效果最佳的培养基为A183C3D3，即MS+1.5 mg/L6-BA+2mg/L KT+0.25mg/L NAA+1.0g/L活性炭+30 g/L蔗糖+5g/L琼脂粉。 2)建立了新台糖22号的筛选体系。Phosphiothricin(PPT)对甘蔗愈伤组织的生长、分化、分化苗的继代、生根和生长阶段的抗性筛选质量浓度分别为1.5 mg/L、1mg/t，、0.75 mg/L、0.5 mg/L、30mg/L。 3)受基因