多重耐药鲍曼不动杆菌的全基因组测序及生物信息学研究-genome sequencing and bioinformatics study of multidrug-resistant acinetobacter baumannii.docxVIP

目录第一章文献综述11.1鲍曼不动杆菌的生物学特性11.1.1鲍曼不动杆菌的定义11.1.2鲍曼不动杆菌的分型11.2鲍曼不动杆菌的耐药现状与流行病学31.3鲍曼不动杆菌的耐药机制41.3.1氨基糖苷类41.3.2β-内酰胺类抗生素41.3.3喹诺酮类51.3.4非酶耐药机制61.4鲍曼不动杆菌感染的治疗策略81.5DNA测序技术发展综述81.6国内外对鲍曼不动杆菌的研究进展111.6.1研究热点111.6.2高通量测序技术在鲍曼不动杆菌基因组学的研究现状121.7本课题研究思路14第二章鲍曼不动杆菌MDR-TJ的全基因组测序152.1实验材料152.1.1菌株152.1.2实验耗材152.1.3实验主要设备182.1.4部分溶液和培养基配制182.2全基因组测序192.2.1基因组DNA样品准备及文库构建192.2.2油包水PCR(emPCR)252.2.3上机测序282.3数据处理292.3.1测序数据处理流程292.3.2序列拼接结果292.4缺口补平302.4.1引物设计302.4.2缺口补平方法33第三章生物信息学分析35第四章结论与展望504.1结论504.2展望50参考文献51发表论文和参加科研情况说明57致谢58第一章文献综述1.1鲍曼不动杆菌的生物学特性1.1.1鲍曼不动杆菌的定义不动杆菌属（Acinetobacter）是指一类需氧的、非发酵糖类、无动力、催化酶阳性、氧化酶阴性、GC含量为39%~47%的革兰氏阴性杆菌[1]。1986年，Bouvet和Grimont根据DNA杂交把不动杆菌分为12个杂交组，其中六个命名为：鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumannii）、鲁菲不动杆菌（Acinetobacterlwoffi）、醋酸钙不动杆菌（Acinetobactercalcoaceticus）、溶血不动杆菌（Acinetobacterhaemolytius）、琼氏不动杆菌（Acinetobacterjunii）、约翰逊不动杆菌（Acinetobacterjohnsonii），其中鲍曼不动杆菌、醋酸钙不动杆菌、Acinetobactergenomicspecies3、Acinetobactergenomicspecies13TU从形态学特征上难以区分，因而被称为鲍曼-醋酸钙不动杆菌复合体[1]。鲍曼不动杆菌菌体大小为1~1.5μm×1.5~2.5μm。鲍曼不动杆菌对营养无特殊要求，能够利用多种碳源，适应能力强，广泛分布于土壤、污水和医院环境中[2]。在实验室环境中，鲍曼不动杆菌能够在普通培养基上生长良好，最适生长温度为35℃。鲍曼不动杆菌对湿热、紫外线、化学消毒剂的抵抗力较强[3]，是一种引起院内感染的重要的条件致病菌，当患者免疫力低下时，容易造成多种院内感染包括：呼吸道感染，如肺炎，血液感染，尿路感染，伤口感染等[4]。由于不动杆菌属具有的天然感受态特性(naturally-competent)使其容易获得外源耐药基因，加上临床上抗生素的滥用，导致多重耐药鲍曼不动杆菌的出现，给临床治疗带来了很大困难。1.1.2鲍曼不动杆菌的分型通过对鲍曼不动杆菌进行精细的种内划分是临床上掌握鲍曼不动杆菌流行爆发的有效工具，每种分型方法选取的指标不同，各有优缺点。常见的对鲍曼不动杆菌进行分型的方法有[1,4]：（1）生物分型：根据生物化学指标可以分为多种生化类型，目前常用的鉴定仪器为法国梅里埃公司的非肠道革兰氏阴性杆菌鉴定系统API20NE，但有时候该系统的敏感性和重现性较差。（2）抗菌谱分型：有研究根据鲍曼不动杆菌对不同抗生素的最低抑菌浓度（MIC）进行分型，细菌对一种抗生素的药敏实验结果有三种：耐药（resistant），中介（intermediate），敏感（susceptible）。这种分型方法通常需要与其他方法结合才能得到较好的结果。（3）质粒分型：提取不动杆菌中的质粒进行凝胶电泳，通过质粒DNA的指纹图谱可以有效地区分不同的流行菌株，相同大小的质粒需要使用限制酶消化后电泳验证。（4）脉冲电场凝胶电泳（PFGE）分型：PFGE通常被视为分子分型的“黄金标准”，这是对鲍曼不动杆菌进行分子分型的有效方法，使用限制性内切酶ApaI和（或者）SmaI对染色体DNA进行消化，用脉冲电场电泳分离这些DNA片段，将获得的指纹图谱与已知的图谱作比对，可以分辨出相应的流行菌株，但该方法耗时较长。（5）基于PCR的分型方法：包括随机扩增多态性DNA方法（RAPD）和REP-PCR，这两种方法操作快速、简单，不需要复杂的仪器，但分辨率不如PFGE，而且重现性较差，基于PCR的方法不适用于大规模的流行病学研究。（6）扩增片段长度多态性（AFLP）分析：AFLP是一种高灵敏度的DNA指纹图谱分析方法，通过限制酶消化，选择性扩增，