肺癌细胞株中mirna的筛选及mir-544a促进肺癌细胞转移的机制研究-screening of mirna in lung cancer cell lines and the mechanism of mir - 544a promoting lung cancer cell metastasis.docx

肺癌细胞株中miRNA的筛选及miR-544a促进肺癌细胞转移的机制研究学位论文答辩日期：指导教师签字：答辩委员会成员签字：独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得（注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空）或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下事项：1、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。2、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中国学术期刊(光盘版)电子杂志社”用于出版和编入CNKI《中国知识资源总库》，授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签字：签字日期：年月日签字日期：年月日肺癌细胞株中miRNA的筛选及miR-544a促进肺癌细胞转移的机制研究摘要肺癌是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一。由于肺癌病人早期症状不典型，同时缺乏敏感的筛查指标及有效的早期确诊方法，大多数患者就诊时已经处于疾病中晚期，错过最佳治疗时机。肺癌患者另一个预后不良的重要原因是容易复发和远处转移，即使早期患者在肿瘤完全切除的情况下也大多死于复发和转移。因此进一步研究肺癌转移的的分子机制，将有助于预防肺癌复发和转移。miRNAs是一种新型肿瘤标记物。致癌类miRNAs通过下调抑癌基因的表达而促进肿瘤细胞的生长，抑癌类miRNAs在转录后水平通过抑制原癌基因的表达而抑制肿瘤。深入研究miRNAs在肿瘤发生、发展中的作用，将为肺癌的诊断和治疗提供新的方案和新的靶点。1.筛选差异表达的miRNAs以两株不同转移能力的肺癌细胞株95C和95D为研究对象。提取总RNA后，利用miRNAs芯片对95C和95D的miRNA谱系分析筛选，获得具有差异表达的miRNAs。结果发现在95C和95D中，microRNAs表达存在差异：其中miR-544a、miR-320、miR-22、miR-103、miR-565和miR-23a等microRNAs，在高转移肺癌细胞株95D中高表达；miR-135b、miR-455-5p、miR-196a、miR-448、miR-888、miR-193a-5p、miR-28-5p和miR-139-5p等microRNAs，在低转移肺癌细胞株95C中高表达。miRNA芯片检测灵敏度较高，但存在一定的假阳性率。因此通过QPCR对差异miRNA进行验证，从而降低假阳性率。QPCR结果显示，miR-544a在高转移细胞株95D中的相对表达水平上调，其相对表达水平约是95C的3倍。该结果与芯片检测结果一致。2.miR-544a通过下调CDH1、上调Vimentin促进肺癌细胞的侵袭能力利用TargetScans数据库，检索到miR-544a与CDH1、GSK-3β有高分数结V合，提示CDH1、GSK-3β可能是miR-544a的靶基因。本实验进而采用双荧光素酶报告系统来加以验证。在CDH1或GSK-3β野生型重组质粒中，与阴性对照组相比，转染miR-544amimic后，荧光强度比值明显降低。结果表明CDH1、GSK-3β是miR-544a的靶基因。进而采用细胞转染的方法，将miR-544amimic转染到低转移肺癌细胞株95C中，进行Transwell侵袭实验、划痕实验、Westernblot等实验检测转染细胞侵袭能力的变化以及CDH1、Vimentin等蛋白表达水平的变化。发现转染细胞侵袭能力增强、CDH1下调、Vimentin上调。3.miR-544a通过下调GSK-3β使肺癌细胞获得肿瘤干细胞的特征将miR-544a的序列克隆到pBaBe-puro载体中，构建了能表达成熟miR-544a的载体，进而转染95C和95D，经QPCR验证：获得了稳定表达miR-544a的细胞系。进一步通过Westernblot和肿瘤球悬浮培养实验研究miR-544a与肿瘤干细胞的关系。Westernblot实验结果显示，95C、95D转染miR-544a后，GSK-3β表达降低，β-catenin和CD133表达增高。结合以上实验结果，表明GSK-3β作为miR-544a的靶基因，受到miR-544a的抑制，导致GSK-3β下降；GSK-3β下降后，β-catenin的降解减少，其浓度升高，激活