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2. cDNA文库的构建 双链平头cDNA的克隆 第31页/共55页 2. cDNA文库的构建 第32页/共55页 三、酵母双杂交系统 第33页/共55页 1. 酵母双杂交系统的基本原理 酵母双杂交系统是由Fields和song 在20世纪90年代建立起来研究蛋白质相互作用的技术手段。 基本原理：真核生物的转录激活子一般是由两个结构上分开的、功能上相互独立的结构域组成，即一个DNA结合域（BD）和一个转录激活域（AD）。BD为识别位于靶基因上游的一个特定区段，并与之激活；AD则同其他成分结合来启动下游基因的转录。 一般情况下它们是同一种蛋白质的两个组成部分，是激活基因转录的必要条件，分开单独存在时仍具有其原来的功能，但不能其始转录。 第34页/共55页 1. 酵母双杂交系统的基本原理 这个方法主要由4个部分组成：AD、BD、报告基因和诱惑基因组成。 AD和BD可来自同一个转录激活子的两个结构域，也可来自两种不同转录因子结构域的不同部分，但在体内其他蛋白质相互作用下都可以重新连接成转录因子，并具有转录功能，激活下游报告基因的表达。 常见的AD和BD来自于Gal4和LexA，下游报告基因的表达产物一般会引起荧光或显色反应，易于检测。 第35页/共55页 1. 酵母双杂交系统的基本原理 第36页/共55页 1. 酵母双杂交系统的基本原理 第37页/共55页 1. 酵母双杂交系统的基本原理 第38页/共55页 1. 酵母双杂交系统的基本原理 两种载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构基因必须在阅读框内融合，融合基因的表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。 Gal4-BD具有核定位信号；Gal4-AD无，故在其氨端或羧端克隆有来自SV40的T抗原一段序列作为核定位序列。 常用的BD基因有：LexA和Gal4的BD编码序列；常见的AD基因有：VP-16和Gal4。 第39页/共55页 2. 酵母双杂交系统的应用 （1）鉴定已知蛋白质之间是否相互作用 将两个待测蛋白的基因分别同BD或AD结构域融合，共转酵母后，如果两个蛋白能相互作用，那么它们的结合会导致两个结构域的结合，从而启动报告基因的转录。 第40页/共55页 （2）筛选与已知蛋白质相互作用的克隆 从cDNA文库中筛选编码与已知靶蛋白特异作用的克隆，发现与已知蛋白相互作用的蛋白或提示其功能。 利用酵母双杂交系统，已经从许多cDNA文库中筛选出了很多编码蛋白质的新基因。 2. 酵母双杂交系统的应用 第41页/共55页 2. 酵母双杂交系统的应用 （3）用于药物的筛选 如利用酵母双杂交系统筛选出了同人视网膜母细胞瘤Rb蛋白结合的肽类物质。对于引发疾病反应的蛋白质相互作用可以采用药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。 第42页/共55页 2. 酵母双杂交系统的应用 （4）鉴定不同突变子与靶蛋白的反应能力 许多P53蛋白突变后丧失了与SV40 T细胞的抗原结合能力。其基因的改变与肿瘤的发生有关，某些序列的变化会导致抑癌功能的完全丧失。 第43页/共55页 2. 酵母双杂交系统的应用 （5）在细胞内研究抗原和抗体的作用 酶联反应和免疫沉淀技术是利用细胞外环境下抗原和抗体的免疫反应研究抗原和抗体的相互作用，在细胞内抗原和抗体的反应则可以通过酵母双杂交进行检测。 第44页/共55页 3. 酵母双杂交系统存在的问题 （1）双杂交分析蛋白相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白质的相互作用依赖于翻译后修饰如磷酸化和二硫键的形成等，而这些反应在核内无法进行； （2）有些蛋白本身具有转录激活作用，容易产生假阳性。 第45页/共55页 四、DNA测序 第46页/共55页 双脱氧末端终止测序法的基本原理 1. Sanger双脱氧链终止法 第47页/共55页 1. Sanger双脱氧链终止法 双脱氧末端终止测序法的基本操作 第48页/共55页 1. Sanger双脱氧链终止法 双脱氧末端终止测序法的基本反应 第49页/共55页 2. Maxam-Gilbert化学修饰法 1977年，美国哈佛大学的Maxam和Gilbert发展出了一种以化学切割为基础的DNA序列分析方法，称为Maxam-Gilbert DNA序列分析法。 基本原理：用特殊的化学试剂处理具有末端放射标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割，由此产生一组不同长度的DNA片段，然后用电泳分离分析断裂片段的大小，放射自显影，读胶确定DNA序列。 第50页/共55页 2. Maxam-Gilbert化学修饰法 Maxam-Gilbert化学修饰法的基本原理 第51页/共55页 2. Maxam-Gilbert化学修饰法 肼作用于T和C，高盐条件下选择性破坏C 第52页/共55页 2. Maxam-Gilbe