溶磷微生物分离、应用及相关基因的克隆和功能鉴定.pdf

摘要 从适应土壤定殖的溶磷微生物中筛选到一株适应生产的溶磷真菌，并进行了其土壤溶磷特 性和溶磷机理初步研究，选取溶磷效果较好的菌株进行了溶磷相关基因的克隆、表达和功能鉴 定，取得以下主要结果： 在磷酸三钙为唯一磷源的无机盐培养基上。以透明圈为指示，通过初筛和复筛，获得效果 稳定的细菌23株，分属6个属11个种；真菌16株，其中有9株草酸青霉(Penic册umoxalicum)， 2株变幻青霉(Penicillium variabile)，l株刺孢青霉(Penicilliumaculeatum)、1株绿色木霉 (Trichoderma nidulans)。 viride)、2株黑曲霉(Aspergillusniger)、l株构巢曲霉(Aspergillus 菌株对不同难溶磷(磷酸三钙、磷酸锌、磷酸铝和磷酸铁)的溶解能力实验表明：细菌对 不同种类难溶磷溶解能力差异显著，真菌的溶磷效果显著高于细菌，16株真菌显著降低PDB d能将各种难溶磷全部溶解。 培养液的pH值，最低达到1．43，固体培养基上培养5 通过16株真菌在不同土壤中的定殖能力和释放难溶磷的效果比较，筛选土壤中定殖和溶 磷效果好的菌株。土培实验结果表明：真菌在土壤中具有较强的定殖能力；不同土壤中真菌的 定殖能力差异显著，同一种的真菌在土壤中的定殖能力也差异显著。真菌释放土壤难溶磷的能 力与其土壤定殖的能力显著相关，菌株定殖能力越强，释放土壤难溶磷效果越好。其中，真菌 d时，菌株数量能 Z33、Zh、ZC、zh3、Z11、Z15、zQ3和Z30在土壤中定殖效果较好，28 达到起始值的10~48倍，有效磷含量增加44％o,,-160％。 通过微生物与作物、土壤的匹配性实验，筛选适应玉米生产的溶磷真菌，并开展了溶磷菌 对土壤微生物多样性影响分析。溶磷微生物与作物的匹配性实验表明：16株真菌在平板上对 分泌物快速生长，并且能溶解平板中的磷酸三钙。选取这6株真菌进行土培实验，结果也证明 和Zh定殖的速度最快，菌剂Z11和Zh处理后，玉米干重和湿重显著增加，在大田试验中， 菌株Zh连续2年都具有较高的增产作用，而菌株Z11只在2010年的试验中具有较好的增产 作用。因此本文获得适应大田玉米生产的溶磷真菌为构巢曲霉Zh。溶磷菌剂对土壤微生物的 结构产生显著的影响，总体趋势为细菌、真菌、放线菌的数量比对照有所增加，土壤中微生物 多样性变化与土壤中细菌数量变化成正相关，土壤中细菌数量越多，土壤微生物多样性越高。 选取具有较好增产效果的构巢曲霉Zh和草酸青霉ZIl，对其产酸的种类，不同温度条件 下土壤溶液pH值的变化、菌株定殖能力以及土壤中不同级别难溶磷的转化规律进行研究，探 讨了溶磷真菌在土壤中溶磷机理和溶磷特性。利用离子色谱对菌株产酸种类进行分析，结果表 明：构巢曲霉Zh和草酸青霉Z11在PDB溶液中能够大量产生乳酸和草酸，培养26h时，溶 液中乳酸和草酸的含量分别达到了372．5“g／mL和593．9 30℃土培条件下，都有很强的定殖能力，并能使土壤溶液的pH值显著降低，土壤溶液pH值 变化与菌株在土壤中定殖的规律一致。不同的温度下，菌株Zh和Z11对土壤中不同级别的难 菌株Zh和Z11溶磷机理为菌株在土壤繁殖过程中分泌有机酸与铁、铝、钙等离子螯合，从而 使难溶磷转化为有效磷。 构建黑曲霉Zh3和草酸青霉Z11的cDNA文库，在磷酸三钙为唯一磷源的无机盐培养基上 以透明圈为指示，筛选溶磷克隆子，结果从菌株Zh3和Z11的cDNA文库中分别筛选到携带 溶磷相关基因的克隆子60个和72个，这些克隆子在第二代转接后功能稳定，确认这些克隆子 所携带的基因具有溶磷的功能。黑曲霉Zh3文库中筛选的克隆子所携带基因序列全长为 CBS5 An07c0220的同源性达到 13．88和Aspergilluscontig 1407bp，与Aspergillusniger niger 98％，与其他菌的同源性低于80％，但目前还没报到该基因在溶磷功能方面的研究，将该基