细胞工程第6章：细胞拆合与克隆技术2.pptxVIP

Chapter 6、细胞拆合与克隆技术6．1 细胞拆合6．1．1 细胞拆合技术发展概况6．1．2 细胞拆合概念与意义 6．1．3 细胞拆合技术与关键6．2 克隆技术6．2．1 克隆的定义及理论基础6．2．2 细胞核移植（也是克隆技术关键）6．2．3 克隆动物一般制备技术6．2．4 体细胞克隆技术6．2．5 克隆技术的应用与意义6．2．6 存在的问题6．2．7 克隆技术发展趋势6．1 细胞拆合6．1．1 细胞拆合技术发展概况6．1．2 细胞拆合概念与意义一、细胞拆合（Cell Reconstruction）：是指从活细胞中分离出细胞器及其细胞组分，在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组形成有生物活性的细胞或细胞器的一种细胞工程技术。二、细胞拆合过程： 细胞器及其分离 同种或异种细胞器与组分重组 新的重组细胞或新的性状或产品 细胞核分离、 细胞核 胞质体的获得 融合 胞质体三、细胞拆合基本方式（目前）四、细胞拆合意义 细胞拆合技术是现代生物工程中令人瞩目的热点课题，细胞拆合与细胞融合技术是细胞工程中的细胞或细胞器水平上主要构建手段，它与基因转移技术、干细胞技术等结合，可以人为地获得新物种或使细胞表达新的性状和新的产物。6．1．3 细胞拆合技术与关键一、细胞拆合技术方法●细胞组分分离技术分级分离法 细胞大小、密度密度梯度离心法 利用 细胞表面电荷流式细胞分选仪分离法 细胞表面标志●细胞破碎方法 超声波破碎法反复冻融法：-70o ~37oC，重复3-4次， 细胞壁破碎化学裂解法：SDS（十二烷基磺酸钠）高速组织捣碎法：需循环水冷却流式细胞分选仪●去核细胞（胞质体）的制备：（见罗立新表5-1）●核体的制备： 贴壁法纯化（见图5-2、5-3） 核体需5-10h再贴壁 培养 分离 完整细胞需2h（菲可液梯度离心）●微核体的制备： CB具有排核作用，形成的微核体； 0．1ug/mL秋水仙胺，48h，处理细胞细胞微核化 离心14000r/min、20min，80-90% 1-3%牛血清密度梯度离心（见图5-4）● 去核细胞的性质：二、细胞拆合技术关键●细胞器与完整细胞融合： ctDNA叶绿体（抗药性、色素） 细胞器分离 细胞器包裹 mtDNA线粒体 形成脂质体或血影细胞 　与完整细胞融合●生物大分子引入完整细胞：　1975年，童第周、牛满江，鲤鱼或鲫鱼mRNA 鲤金鱼 金鱼受精卵 鲫金鱼6．2克隆技术6．2．1 克隆的定义及理论基础一、克隆（clone）： ●克隆——原意为“扦插的枝条”无性繁殖系 基因克隆（实为基因扩增） 细胞克隆（实为有丝分裂的细胞集落） 个体克隆（如植物快繁个体） 引伸为“克隆操作技术，即核移殖技术”二、理论基础： 体细胞具有细胞全能性三、发展历程：6．2．2 细胞核移植（也是克隆技术关键）一、定义 细胞核移植技术：是指利用显微操作技术将某种动物细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵内的精细技术； 它可分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植； 它可用于发育生物学、细胞生物学、分子生物学等问题的研究，实现不同细胞核与细胞质的组配，还能培育出新物种。二、发展历程三、核移植技术●供体和受体的准备 鱼类： 供体——囊胚细胞或成体细胞， 受体——成熟的卵细胞 发育 （人工催产、水中激活） 时间 两栖类： 配合 供体——囊胚细胞或成体细胞， 好 受体——成熟卵细胞（人工针刺）鸟类、爬行类：未知哺乳类：供体——早期胚胎细胞、胚胎干细胞、体细 胞；后用体细胞，如乳腺细胞、粘 膜上皮细胞；合子核到64细胞期， 0.2%链霉蛋白酶预处理,溶去胚胎 胶膜及透明带,分离单个卵裂球； 受体——去核卵母细胞、受精卵、2细胞胚 胎（第一极体成熟时期去核）；●去卵膜和卵核——用玻璃微针（尖为2-4um） 鱼卵——借助第二极体标志，去核； 两栖卵——紫外线去核； 哺乳卵——借助第一极体；●供体细胞制备： 胚胎或组织机械切割 置细胞分离液（含胰蛋白酶）处理几分钟 单细胞短期培养●移植 选择合适微吸管（比细胞核大，比供体细胞小），不能多带细胞质，须30-40min内完成操作过程，温度16-18oC；●显微操纵术：原子力显微镜、显微操纵