PPARα激动剂抑制脂多糖you导THP-细胞的细胞组织因子表达.docVIP

　　PPARα激动剂抑制脂多糖诱导THP-1细胞的细胞组织因子表达 作者：董春霞，胡豫，王华芳，孙春艳，王雅丹，何文娟，张小平 【摘要】 　　本研究探讨过氧化物酶体增殖物激活型受体α（peroxisome proliferator-activated receptor-α， PPARα）的激动剂对单核细胞株THP-1中组织因子（tissue factor, TF）表达的影响。用不同浓度的PPARα激动剂非诺贝特（fenofibrate）预处理单核细胞THP-1一定时间，然后分别用RT-PCR和 199培养液、胎牛血清(Hyclon公司产品)。LPS（Sigma公司产品）。RT-PCR kit （Toyobo公司产品）， TRIZOL试剂（上海华舜生物公司产品）， TF以及TFPI单克隆抗体（HTI公司产品），羊抗小鼠抗体（北京中山公司产品），非诺贝特（法国利博福尼公司产品）。 　　方法 　　细胞培养THP-1单核细胞悬浮于M199培养液 (含10%胎牛血清)，在37、 5% CO2条件下培养。THP-1细胞分别给以不同浓度的PPARα激动剂—非诺贝特（0、 10 、50和100 μmol/L），然后加入LPS（100 μmol/L）作用一定时间。LPS的浓度根据预实验确定。用台盼蓝检测细胞活力。 　　THP-1细胞TF mRNA表达的RT-PCR检测按照试剂说明书用TRIZOL提取THP-1细胞总RNA，用RT-PCR kit 进行反转录， TF上游引物序列5’-GCTAGTATTATGGGCGTGAA- 3’ ;下游引物序列, 5’-GAATACCAATGTCTCCTGCA-3’。 内参照β-actin上游引物序列5’-GCCGGACTCGTCATACTCCT-3’ ; 下游引物序列5’- ATGCCATCCTGCGTCTGGA-3’。扩增按照下列条件进行： 94 预变性5分钟，进行以下循环： 94 30秒，50 30秒，72 45秒，共30 个循环，最后72延伸5分钟。扩增产物用琼脂糖电泳，溴化乙锭显色。内参照β-actin评价反应产物。 　　THP-1细胞TF蛋白表达的SF, 1 μg/ml aprotinin）中，用DC Protein Assay kit进行总蛋白定量，蛋白上样，10%SDS分离蛋白，转至硝酸纤维素滤膜上。含5%脱脂奶粉的封闭液4过夜。一抗于37孵育1小时，分别用PBS和TBS洗3次，二抗于37孵育1小时。ECL法检测蛋白质表达。同样方法测定TFPI蛋白量。 　　统计学处理 　　所有数据采用±SD表示，数据分析处理用SPSS 11.0软件。不同浓度非诺贝特处理组及对照组间比较采用one-RNA 水平和TFPI mRNA水平变化 　　检测结果见图1、2和表1，2。 LPS预刺激2小时后可见到细胞有TF表达。与对照组比较，10 、50和100 μmol/L非诺贝特处理的细胞TF mRNA水平降低（Plt;0.01），呈现浓度依赖性。但是内源性TF活性的抑制物-组织因子途径抑制物（ tissue factor pathRNA水平在各组中没有检测到显著差异（Pgt;0.05）。Table 1. Effect of fenofibrate on TF mRNA and protein expression（略） 　　THP-1中TF蛋白和TFPI蛋白表达水平变化 　　无LPS刺激时，未见单核细胞有TF的蛋白表达。单纯100 μmol/L LPS刺激后可见THP-1有较多TF蛋白表达（光密度积分比值0.96±0.09 ），浓度大于10 μmol/L的各组非诺贝特抑制了由LPS诱导的单核细胞THP-1的TF蛋白表达（0.42±0.08，0.58±0.06，0.74±0.06 ， Plt;0.01），呈现浓度依赖性（图3，表1），但非诺贝特对TFPI的蛋白表达没有作用（Pgt;0.05）（表2）。Table 2. Effect of fenofibrate on TFPI mRNA and protein expression（略）讨论 　　本实验证实PPARα激动剂——非诺贝特下调LPS诱导的THP-1细胞中TF mRNA和蛋白表达，但是对TFPI无影响。实验结果首次提示PPARα的激活在其调控动脉粥样硬化血栓形成中的可能作用。我们证实，未经诱导的THP-1单核细胞无TF mRNA和蛋白表达，LPS可以诱导THP-1细胞表达TF。用非诺贝特预处理单核细胞可以抑制LPS诱导的TF mRNA和蛋白表达，但是没有观察到非诺贝特对TFPI的mRNA及蛋白表达有抑制作用，说明非诺贝特对TF启动的凝血途径具有抑制作用，并且这种抑制作用不是通过影响TF的内源性抑制物-TFPI的合成来实现的，而是对TF mRNA和蛋白表达直接发挥