Stat信号转导通路调控bcl成员表达及抑制结肠癌细胞凋亡的机.docVIP

　　Stat3信号转导通路调控bcl2成员表达及抑制结肠癌细胞凋亡的机 作者：马向涛，余力伟，王杉，张在兴，杜如昱，崔志荣 【摘要】 目的 转录信号转导子与激活子3（Signal transducers and activators of transcription 3, Stat3）通路受细胞因子与生长因子的刺激而活化，参与调节细胞的增殖、分化与凋亡，探讨Stat3反义寡核苷酸诱导结肠癌细胞凋亡的作用机制。方法 用阳离子脂质体介导Stat3反义寡核苷酸转染人结肠癌HCT116细胞，MTT法检测细胞增殖状态；流式细胞术检测细胞周期与凋亡；cl1、Caspase3的表达。结果 转染Stat3反义寡核苷酸后HCT116细胞增殖受抑制，凋亡细胞增多，Stat3、pStat3与bcl2家族成员表达水平下降。结论 Stat3信号转导通路活性增高可能与结肠癌发生发展有关，阻断Stat3通路可以诱导结肠癌细胞凋亡。 【关键词】 结肠癌；信号转导通路；增殖；凋亡 　　Stat3 Signaling Pathily Members and Promotes Survival of Human Colon Cancer Cells 　　Abstract：Objective Signal transducer and activator of transcription 3 (Stat3) is activated in response to cytokines and groulation, and activation of Stat3 is involved in modulating cell proliferation, differentiation and apoptosis. The purpose of the study ine colon cancer cell lines to determine portant role in the process of apoptosis in colon cancer cells. Methods Protein lysates colon cancer cells. Human colon cancer cell line HCT116 ediated by liposome, MTT assay easure the proliferation, floetry easured by ily members. Conclusion Constitutive activation of Stat3 is associated ；Signal transduction pathine2000（美国GIBCOL/BRL公司），转染过程参照GIBCOL/BRL公司手册。 　　1.4 细胞增殖状态检测（MTT法） 取第3～6代生长状态良好的对数生长期细胞，常规消化、分离、收集细胞、细胞计数及测定细胞活力，活细胞率达95%，按每孔4.0×105个细胞接种于96孔板中，贴壁后，无血清培养细胞16～24h，使细胞同步化。实验分为以下4组：（1）空白对照加无血清培养组；（2）正义寡核苷酸组；（3）错配寡核苷酸组；（4）反义寡核苷酸组，每个研究点设置3组平行对照，重复3次实验取平均值。分别加入脂质体及Stat3正义寡核苷酸、错配寡核苷酸与反义寡核苷酸继续培养，浓度分别为0、5、10、20μM，第0、24、48、72h分别加入MTT 5mg/ml （美国Sigma公司），继续培养4h，每孔加入DMSO 200ml，酶标仪测定540nm吸收值，绘制生长曲线，见图1。 　　1.5 细胞周期检测 细胞同步化后分别加入脂质体及Stat3正义寡核苷酸、错配寡核苷酸与反义寡核苷酸继续培养，第0、24、48、72h分别消化细胞，0.5ml PBS重悬细胞，70%冰乙醇固定细胞过夜，加入RNAase A至终浓度50mg/ml，37℃恒温水浴1h，加入PI（美国Sigma公司）至终浓度50mg/ml，4避光染色1h，上流式细胞仪FACScan（美国BectonDickinson公司）检测，资料用Cell Quest细胞周期分析软件处理。 　　1.6 细胞凋亡检测 同步化处理及单细胞悬液制备同前，应用凋亡检测试剂盒，PBS离心洗涤2次，200ml结合缓冲液重悬，加入ANNEXTIN VFITC至终浓度1mg/ml，加入PI至终浓度2.5mg/ml，室温避光染色15min，上流式细胞仪检测。 　　1.7 cl1、Caspase3抗体（美国Santa Cruz公司），工作浓度11000，GAPDH 作为内参照，辣根过氧化物酶结合的二抗，工作浓度11000。用ECL化学发光试剂盒检测杂交信号。 　　1.8 吸光度