rAAV -GPⅡb-GPⅢa载体构建和体外表达、功能实验.docVIP

　　rAAV 2-GPⅡb/GPⅢa载体构建和体外表达、功能实验 作者：王凯，彭建强，陈方平，吴小兵 【摘要】 为了研究rAAV载体介导的血小板无力症基因治疗的可行性，构建了由CMV启动子调控的rAAV2-b、rAAV2-a病毒载体，并采用多种方法验证了rAAV2-b和rAAV2-a病毒载体在真核细胞中的表达能力，其中包括用RT-RCR方法检测BHK-21细胞感染24小时（MOI=1×105 v.g/cell)后目的基因在mRNA水平的表达，用流式细胞术的方法检测不同MOI和目的基因表达之间的量效关系，采用OI=1×105 v.g/cell)目的基因在蛋白水平的表达，用免疫荧光法检测BHK-21细胞感染48小时后（MOI=105 v.g/cell）目的基因在细胞表面的表达，以及应用PAC-I结合试验验证所表达的GPb/Ⅲa蛋白功能。结果表明，在MOI=1×105 v.g/cell条件下，在BHK-21细胞感染24小时后即可在mRNA水平上检测到目的基因的表达，在48小时可在蛋白水平检测到目的基因的表达；在一定剂量范围内目的基因的表达量随着MOI的增加而增加，但MOI过高反而使表达量下降，目的基因表达产物活化之后能与PAC-I结合，并具有正常的生物学活性。结论：rAAV2载体能有效地介导GPb、GPa基因在真核细胞内表达，所表达的产物都具有正常的生物学活性，此结果为rAAV2载体在血小板无力症基因治疗中的应用打下了基础。 【关键词】 腺相关病毒载体 　　Construction of rAAV2-GPb/Ⅲa Vector and Test of Its Expression and Function In Vitro 　　　Abstract This study ed to explore the possibility of rAAV2 vector-mediating gene therapy for Glanzmann′ s thrombasthenia.The rAAV2-GPb/Ⅲa vector ammal cell ined by different methods，such as: detection of mRNA expression in BHK-21 cells after 24 hours of infection (MOI=1×105 v.g/cell) ed by RT-PCR; the relation betmunofluorescence，and the biological function of expressing product ined by PAC-1 conjunct experements.The results shoRNA level could be detected in BHK-21 cells after 24 hours of infection at MOI=1×105 v.g/cell and the GPⅡb/Ⅲa gene expression in protein level could be detected in BHK-21 cells after 48 hours of infection at MOI=1×105 v.g/cell.In certain range，quantity of GPb/Ⅲa gene expression increased bined al biological function.In conclusion，rAAV2 vactor can effectively mediate GPb and GPⅢa gene expressing in mammal cells，and the products of these genes exhibit biological function.This result may provide a basis for application of rAAV2 vector in Glanzmanns thrombasthenia gene therapy in furture. 　　Key ann′s thrombasthenia; GPb/Ⅲa 血小板无力症（Glanzmann′s thrombasthenia GT）是一种常染色体隐性遗传疾病，是一种由于先天性血小板膜糖蛋白GPb/Ⅲa基因缺陷，使得血小板膜糖蛋白GPb/Ⅲa异常，引起血小板聚集功能异常而导致的一种出血性疾病［1］，其主要的临床症状是自幼的皮肤、粘膜出血，表现为皮肤瘀斑、 鼻出血、月经过多等等。GT分为两型：I型GT血小板对纤维蛋白完全没有反应，血块不能退缩，血小板表面的GPb/Ⅲa小于 5%；型GT