Stat信号转导通路调控Ca spase表达促进结肠癌细胞凋亡的机制.docVIP

　　Stat3信号转导通路调控Caspase3表达促进结肠癌细胞凋亡的机制 【摘要】 目的 本研究探讨Stat3/Caspase3信号转导通路调控结肠癌细胞凋亡的作用机制。方法 用阳离子脂质体介导Stat3反义寡核苷酸转染人结肠癌HT29细胞，MTT法检测细胞增殖状态；流式细胞术检测细胞周期与凋亡；I1640培养基（美国GIBCOL/BRL公司）。 1.2 Stat3寡核苷酸的合成与纯化 Stat3反义寡核苷酸根据Stat3翻译起始点合成，同时本研究还设立了正义寡核苷酸链和错配寡核苷酸链作为对照组，错配链的序列在GenBank数据库进行同源性检索，未发现同源序列。Stat3反义寡核苷酸序列：5 CCATTGGGCCATCCTGTTTCT 3’；Stat3正义寡核苷酸序列：5 AGA AACAGGATGGCCCAATGG 3’；Stat3错配寡核苷酸序列：5 CCATTGCGCCATCGTGTTACT 3’。以上寡核苷酸由美国Santa Cruz公司合成及纯化。 1.3 阳离子脂质体转染 LipofectAmine2000 （美国GIBCOL/BRL公司），转染过程参照GIBCOL/BRL公司手册。分为空白对照组、正义寡核苷酸组、错配寡核苷酸组与反义寡核苷酸组。 1.4 细胞增殖状态检测（MTT法） 接种细胞于96孔板，贴壁后，无血清培养细胞16～24h，使细胞同步化。实验分4组进行，即空白对照组、正义寡核苷酸组、错配寡核苷酸组与反义寡核苷酸组。每个研究点设置3组平行对照，重复3次实验取平均值。空白对照组加无血清培养基，正义寡核苷酸组、错配寡核苷酸组与反义寡核苷酸组分别加入脂质体及Stat3正义寡核苷酸、错配寡核苷酸与反义寡核苷酸至浓度达到0、5、10、20μM，第0、24、48、72h分别加入MTT 5mg/ml （美国Sigma公司），继续培养4h，每孔加入DMSO 200μl，酶标仪测定540nm吸收值，绘制生长曲线。 1.5 细胞周期检测 无血清培养细胞16～24h，使同步化，空白对照组加无血清培养基，正义寡核苷酸组、错配寡核苷酸组与反义寡核苷酸组分别加入脂质体及Stat3正义寡核苷酸、错配寡核苷酸与反义寡核苷酸继续培养，第0、24、48、72h分别消化细胞，0.5ml PBS重悬细胞，70%冰乙醇固定细胞过夜，加入RNAase A至终浓度50μg/ml，37恒温水浴1h，加入碘化丙啶（美国Sigma公司）至终浓度50μg/ml，4避光染色1h，上流式细胞仪FACScan（美国BectonDickinson公司）检测，资料用Cell Quest细胞周期分析软件处理。 1.6 细胞核蛋白与总蛋白提取 1.6.1 细胞核蛋白提取 收集细胞悬液；用低渗缓冲液于冰上裂解细胞10 min；4条件下13 000 r/min离心1min；4条件下用高盐缓冲液重悬粗提的细胞核，振荡30min；4条件下13 000r/min离心10min；取上清为核提取物，贮存于80℃于2个月内用完。 1.6.2 总蛋白提取 参照Santa Cruz公司蛋白提取方法，应用RIPA缓冲液裂解结肠癌细胞得到总蛋白。 1.6.3 蛋白浓度测定方法（Bradford法） 以牛血清蛋白（BSA）作为标准品，根据蛋白定量试剂盒（美国BioRad公司）说明绘制蛋白定量标准曲线，于分光光度计595nm下测光密度值，计算提取液蛋白浓度。 1.7 illipore公司），封闭后，加入一抗（Stat3，pStat3，Caspase3，Bcl2，BclxL，GAPDH）（美国Santa Cruz公司），工作浓度11000；辣根过氧化物酶结合的二抗（英国Amersham公司），工作浓度11000。用ECL（英国Amersham公司）化学发光试剂盒检测杂交信号。 1.8 吸光度测定 用PhosphoImager图像分析仪（美国Molecular Dynamics公司）测定条带的吸光度A，以A值代表蛋白的相对表达量。 1.9 统计方法 应用SPSS 12.0统计学软件，采用独立样本t检验，P＜0.05为有统计学差异，差异有显著性。 2 结果 2.1 Stat3反义寡核苷酸可以抑制结肠癌细胞增殖 Stat3反义寡核苷酸作用HT29细胞72h后，G1期细胞比率由61.40%上升至75.60%，S期细胞比率由21.38%下降至11.72%，细胞增殖受抑制，见表1。表1 HT29细胞周期比率检测2.2 Stat3反义寡核苷酸可以促进结肠癌细胞凋亡 HT29细胞在转染Stat3反义寡核苷酸72h后，凋亡细胞百分比由5.60%增加至25.51%，见表2。表2 HT29细胞凋亡比率检测（ 2.3 Stat3反义寡核苷酸可以使Stat3信号传导通路成员活