Survivin-siRNA在体外you导Panc-细胞凋亡的实验研究.docVIP

　　Survivin-siRNA在体外诱导Panc-1细胞凋亡的实验研究 作者：邱文洪 郭凯文 宋文剑 沈关心 【摘要】 探讨RNA干扰技术抑制Survivin对人胰癌细胞株Panc-1细胞凋亡的影响。方法： 体外设计、合成针对survivin基因的小分子干扰RNA(survivin-siRNA)，应用脂质体介导survivin-siRNA转染Panc-1细胞后，MTT试验测定转染细胞的增殖抑制率，RT-PCR检测细胞survivin mRNA表达，琼脂糖凝胶电泳分析其对Panc-1细胞凋亡诱导作用。结果： 转染survivin-siRNA的Panc-1细胞增殖明显受抑制，与对照进行比较，具有显著性差异（Plt;0.01）；经琼脂糖凝胶电泳，转染survivin-siRNA的Panc-1细胞可见到DNA梯形条带，而对照细胞未见到。结论：survivin-siRNA能够显著诱导Panc-1细胞凋亡。 【关键词】 siRNA survivin Panc-1 凋亡 　　The Study of siRNA of Survivin Gene Induced Apoptosis in Panc-1 Cell Line in Vitro Qiu edicine, Jianghan University, ethods: The small interference RNA （siRNA） targeting survivin gene ic DNA from Survivin siRNA transferred Panc-1 cells sho other cells did not. Conclusion: Survivin siRNA could effectively induce apoptosis in Panc-1 cells. 　　Key ineTM2000购自Invitrogen公司；MTT(噻唑蓝)购自SantaCruz公司；Taq DNA聚合酶，逆转录试剂盒购自MBI公司；RPMI1640培养基，TRIzol RNA分离试剂盒购自GIBCO公司；细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒购自Beytime Biotechnology公司。 　　1.2 设计survivin特异性siRNA 根据survivin基因在GenBank中的序列，应用美国Ambion公司的设计软件设计相应的siRNA，同时在GenBank表达序列标签(EST)数据库中用BLAST检索，确认所设计siRNA序列的唯一性，人工合成针对740～761nt位碱基靶序列的两条寡核苷酸链模板。 　　1.3 合成survivin特异性siRNA 稀释上、下游模板，终浓度均为100μmol/L，分别与T7启动子序列连接，705min，室温5min，37延伸30min，体外转录，372h，siRNA的正、反义RNA结合，37过夜，去除前导序列和DNA模板，372h，用层析方法纯化siRNA。测定合成的siRNA 260nm的吸光度(A)值，定量后-70保存。 　　1.4 细胞转染 采用常规方法培养Panc-1细胞，取对数期生长的细胞用于实验。将处于对数生长期的Panc-1细胞接种于6孔板，当细胞融合达70%，按照lipofectamine2000试剂盒说明书将survivin特异性siRNA（survivin-siRNA）转染Panc-1细胞。同时转染GAPDH特异性的siRNA（GAPDH-siRNA）作对照。 　　1.5 采用MTT法检测细胞增殖抑制实验 转染48h后，离心收集上述各组1×106个细胞。24ｈ后应用MTT法，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度(Ａ)值，每个浓度设3个复孔，计算肿瘤细胞抑制率=（1-实验孔A值/对照孔A值）×100%。 　　1.6 转染细胞survivin mRNA表达的检测 转染48h后，离心收集上述各组1×106个细胞。按照试剂盒说明提取总RNA逆转录成cDNA，进行PCR反应检测survivin mRNA的表达。引物序列为，上游引物：5-CATGGGTGCCCCGACGTT-3’，下游引物：5-TCAATCCATGGCAGCCAGCT-3’，并以β-actin为内参照，扩增片段长度313 bp。反应条件：94预变性5min，94变性1min、50退火45s、72延伸1min，共30个循环，最后延伸10min。产物经20ｇ/Ｌ琼脂糖凝胶电泳，观察结果并拍照。 　　1.7 采用DNA凝胶电泳检测细胞凋亡 转染48h后，离心收集上述各组1×106个细胞。洗涤并重悬，加入细胞裂解液（1% NP40，20mmol/L EDTA pH8.0，50mmol/L Tris-cl pH7.5），离心取上清加入10%SDS、蛋白酶K，5