RNAi抑制NEK细胞TGFβ表达的研究.docVIP

　　RNAi抑制NEK293细胞TGFβ1表达的研究 作者：崔飞伦，邱镇，陆洪兵，姚震，林大春 【摘要】 目的： 探讨针对转化生长因子β1（TGFβ1）的小干扰RNA（siRNA）对大鼠肾间质细胞系（NEK293）TGFβ1的表达、细胞周期的抑制及细胞凋亡的诱导作用. 方法： 利用RNA干扰（RNAi）效应设计针对TGFβ1的不同siRNA，构建表达载体质粒并转染NEK293细胞系. RTPCR和）迅速重建和长期的成纤维细胞激活［1］，已知的主要效应细胞为成纤维细胞、肾间质细胞等. 体外研究［2］表明，转化生长因子β1（TGFβ1）是肾间质细胞的主要调控因子. 本研究应用TGFβ1特异性小干扰RNA(siRNA), 以质粒载体转染大鼠肾间质细胞NEK293，观察特异性siRNA对TGFβ1的表达，NEK293细胞周期及凋亡的影响. 　　1材料和方法 　　1.1材料HEK293细胞（美国Clontech公司）；Lipofectamine（美国Gibco公司）；RTPCR 试剂盒（日本TaKaRa 公司）；化学发光试剂，（美国Santa Cruz公司）；噻唑蓝显色剂（MTT）、碘化丙啶（PI）荧光染料、TritonX100打孔剂（美国Sigma公司）；DOSPER脂质体（美国Roche公司）；荧光显微镜（德国Opton公司）；TECAN sunrise型自动酶联免疫检测仪，coulter Epics XL流式细胞仪，LS6500液闪计数仪（美国Beckman公司）. 　　1.2方法 　　1.2.1特异性siRNA设计及载体的构建候选siRNA序列通过BLAST工具搜索,去掉与人类RNAs同源性的靶序列，最后选取3个siRNA. 根据pSilencer3.1H1质粒载体使用说明，将编码siRNA的双链互补DNA片段插入该载体的BamHI/Hind位点之间以制备发夹cDNAs［3］. 表达这3种siRNA的重组质粒分别命名为psiRNA1,2,3. 以BamHI和Hind酶切后电泳观察酶切特异性片段的大小，并对纯化的siRNA片段进行DNA测序分析. 另合成一不针对任何基因的无意义片段作为对照. 　　1.2.2细胞培养及转染HEK293细胞以含100 mL/L灭活小牛血清的RPMI1640培养液，于37，50 mL/L CO2，饱和湿度培养，2 d换液1次. 取对数生长期细胞进行实验. 按lipofectamineTM2000脂质体转染法，将5 μg psiRNA(13)和无意义对照质粒转染到HEK293细胞中，6 h后更换正常培养基，12 h后荧光显微镜及流式细胞仪观察转染效率. 　　1.2.3RTPCR检测psiRNA1,2,3三个实验组及对照组分别收集细胞（细胞总数为1×107个）按Trizol试剂操作步骤提取总RNA，选用一步法RTPCR试剂盒. 具体参数及条件根据引物的Tm值和扩增片断的大小进行调整. 　　1.2.4TT比色实验1×104 HEK293细胞接种于96孔培养板, 37，50 mL/L CO2，饱和湿度培养1 d. 按实验要求分别在细胞中加入终浓度为200 nmol/L的siRNA，中止培养4 h前加入MTT，应用酶标仪进行检测. 检测490 nm波长处的吸光度A值,计算细胞增殖抑制率：增殖抑制率(%) = (1-A实验组/A对照组) ×100%. 　　1.2.6细胞凋亡检测3 mL培养液含5×105细胞培养于6孔板，用预冷的700 mg/L乙醇固定，4过夜，PI（50 mg/L）染色，分析亚二倍体峰. 调整细胞密度为5 ×106/mL，取1 mL细胞悬液，1000 r/min 4离心10 min，重复2次，将细胞重悬于200 μL结合缓冲液，加入10 μL膜连蛋白 (Annexin V2F ITC)和5 μL碘化丙锭(PI) ，避光室温反应15 min，加入300 μL结合缓冲液，流式细胞仪检测细胞凋亡情况. 　　1.2.7转染效率的检测试剂盒中提供带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体作为阳性对照用以监测转染效率. 按说明书转染, 24 h后收集细胞, PBS洗涤后固定在20 g/L多聚甲醛中,流式细胞仪检测. 　　统计学处理： 以SPSS11.0软件进行分析. 组间差异比较采用方差分析及LSDt检验，Plt;0.05为差异具有统计学意义.2结果 　　2.1siRNA转染效率流式细胞分析显示，几乎所有的细胞都摄取了GFP的绿色荧光. 由于siRNA分子远小于质粒分子，故转染siRNA时转染效率应大于70%（图1）. 　　A: siRNA1组; B: siRNA2组; C: siRNA3组. 　　图1各实验组siRNA表达载体转染×200（略） 　　2.2TGFβ1 mRNA及蛋白的表达特异性s