Survivin在槲皮素you导肝癌细胞SMMC凋亡中的调节作用研究.docVIP

　　Survivin在槲皮素诱导肝癌细胞SMMC7721凋亡中的调节作用研究 【摘要】 目的研究槲皮素诱导肝癌细胞SMMC7721凋亡，探讨其诱导SMMC7721细胞凋亡与survivin蛋白表达和caspase-3活性的关系。方法采用MTT法检测槲皮素对肝癌SMMC7721细胞生长的抑制作用，Hoechst 33258荧光染色对细胞凋亡进行形态学检测，流式细胞术检测细胞周期变化，免疫细胞化学检测survivin蛋白表达，分光光度法检测caspase-3的活性变化。结果槲皮素抑制肝癌SMMC7721 细胞增殖的作用明显，且呈浓度和时间依赖性，槲皮素处理48 h的IC50为84.24 μmol·L-1。形态学检测显示出细胞凋亡的特征变化，流式细胞仪检测表明经槲皮素处理，肝癌SMMC7721 细胞周期阻滞于G0/G1期，且SMMC7721细胞survivin蛋白表达下降，caspase-3活性升高。结论槲皮素能诱导SMMC7721细胞凋亡，其机制可能是使肝癌SMMC7721 细胞周期阻滞于G0/G1期，并下调survivin蛋白的表达，直接激活caspase-3而诱导SMMC7721细胞凋亡。 【关键词】 槲皮素； 肝癌细胞SMMC7721； 细胞凋亡； Survivin； Caspase-3 Abstract：ObjectiveTo investigate the apoptosis of SMMC7721 hepatic cancer cells induced by quercetin and its relationship icroscope. Cell cycle etry (FCM). Expression of survivin protein munocytochemistry staining. Activity of caspase-3 etry. ResultsQuercetin had a significant inhibition on groe-dependent manner. The IC50 ol·L-1 after cells icroscope. It a cell lines SMMC7721； Apoptosis; Survivin； Caspase-3 槲皮素（Quercetin, Que, 3,5,7,3’,4’-五羟基黄酮）广泛存在于植物界，大约68 %的植物中都含有。槲皮素药理作用广泛，具有降血压、降血脂、扩张冠状动脉、抗血小板聚集、抗炎、抗过敏、抗心律失常和清除自由基等多种生物活性及药理作用［1～5］。近年发现槲皮素不仅对多种致癌剂、促癌剂有拮抗作用，而且可以抑制多种恶性肿瘤细胞的生长［6～10］。Survivin蛋白是新近发现的凋亡抑制因子，在肿瘤的发生发展中具有重要地位。槲皮素对肿瘤细胞中survivin蛋白表达的影响，至今还不十分清楚。因此本课题试图研究survivin表达在槲皮素诱导SMMC7721细胞凋亡中的调节作用，为探讨槲皮素诱导肝癌细胞SMMC7721细胞凋亡的机制提供实验依据。 1 材料 RPMI 1640培养液，胎牛血清（Hyclone公司），槲皮素（Sigma公司），Hoechst33258（Sigma公司），免疫组化染色SP试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），兔抗人survivin多克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），Caspase-3分光光度法检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）。 2 方法 2.1 细胞培养人肝癌细胞株SMMC7721，细胞单层接种在含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中，在饱和湿度，温度为37，CO2浓度为5％的培养箱中培养。 2.2 细胞生长抑制肝癌细胞SMMC7721，5×104个/ml，接种于96孔培养板，每孔200 μl。培养24 h。更换10%FBS的含药培养基，使槲皮素终浓度为12.5，25，50，100，200 μmol·L-1，每一浓度重复5孔，分别培养24，48，72 h，培养终止前4 h加入MTT（5 mg·L-1）每孔20 μl，37孵育。终止时弃上清后每孔加入150 μl二甲基亚砜，振荡混匀10 min，使结晶物充分溶解后，在酶标仪（λ= 490 nm）上测各孔的吸光度（OD）值，重复 3 次，按下式计算细胞生长抑制率： 肿瘤细胞生长抑制率（IR）=｛1-实验组平均OD值对照组平均OD值｝×100%（以空白组OD值调零） 2.3 细胞形态学变化观察取对数生长期SMMC7721细胞5×104个，加入放有盖玻片的六孔板内。培养24 h后，更换10%FBS的含药培养基，设空白对照组和加药实验组，使加药组槲皮素终浓度分别达到40，80，160 μmol·L-1，继续培养 48