培养条件决定由戊糖乳杆菌LPS26生产两种细胞外多糖平衡.ppt

1 菌株和培养基条件 戊糖乳酸杆菌LPS26 （L. pentosus LPS26） 乳酸乳球菌乳酸亚种IPLA947 （Lactococcus lactis subsp. lactis IPLA947 ） 可在优化的半合成培养基SDM中培养获得细胞外多糖（EPS） 培养基组成： 吐温80（Tween 80 ） 1g/L 柠檬酸铵 2g/L 乙酸钠 5g/L MgSO4·7H2O 0.1g/L MnSO4 0.05g/L K2HPO4 2g/L 酵母浸粉 5g/L 蛋白胨 10g/L pH 6.0 为进一步优化培养基成分，添加不同碳源进行实验。 2 对细胞表面进行化学处理 每10ml样品过夜培养后以5ml以下任何一种溶液重悬处理： 30％质量分数的十二烷基磺酸钠于45°C下处理30min 0.05M NaOH于20°C处理30min 蛋白酶K（1.5mg/ml）于50°C处理30min 3 EPS的分离纯化 在前人方法上进行改进如下： 10ml样品以30W 1Hz超声波处理了10min 用10％质量分数的三氯乙酸搅拌处理30分钟 4℃10000g离心10min以去除细胞核蛋白 以2倍体积的酒精沉淀过夜 ，重溶于1ml蒸馏水中 4℃中透析48h，期间每12h换水一次 纯净的EPS被冻干以便于进行进一步定量和成分分析 4 EPS的定量 对含EPS的样品进行高压液相色谱(HPLC)系统进行过滤层析(SEC) ，组分用一个以TSK-Gel precolumn柱保护的TSK-Gel G5000 PWXL柱收集。HPLC条件如下： 流动相是0.1M的NaNO3 柱温是40℃ 流速是0.6ml/min 进样量是50ul 5 单糖的分析 存在两种EPS (EPS A and EPS B) 分离得到的EPS蒸馏水透析48h以去除来自流动相的NaNO3然后将其冻干 依靠根据alditol acetate方法进行的气相色谱来测定多糖成分 样品以丙酮（1ul对应每ug EPS）溶解 通过与Hewlett-Packard 5972选择性质量检测器连接的Series II Hewlett-Packard 5890仪和按流注射模式操作的一根石英毛细管（0.25 mm by 30 m; SPTM 2330）进行分析 烤箱的温度保持在220℃ 6 发酵条件 所有的发酵实验都是在一个750ml的含葡萄糖（20g/L） 的SDM培养基中进行的 以30°C过夜培养的培养物按2％体积分数接种 通过一个InPro 3000/225探针进行测量后自动补加5.7N的NH4OH来控制pH 转速为150rpm 当菌体达到指数生长期时，补加新鲜的培养基使之开始从最低稀释度下进行发酵 分别对多种碳源（葡萄糖、乳糖、果糖和甘露醇），不同糖浓度（5，20，30和40g/L），不同温度（20，25和30°C）以及不同pH水平（6.0，5.0和不进行控制）进行了实验 对细菌的生长情况（以CUF/ml表示），pH（未控制pH培养物）和产物EPS的量进行了测定，HPLC对糖和有机酸进行检测 7 动力学参数 最大生长率μmax＝〔ln（X1-X0）/（t1－t0）〕，其中X1和X0是CFU/ml的数，t0和t1是对数生长期起止时间 EPS产率(YEPS)以每克糖产生的EPS毫克数表示 单位体积产率(Pv)以每小时每升培养液中产生的EPS毫克数表示 8 以牛奶进行培养 在商品UHT培养基添加了2％的脱脂乳糖粉末作为两种菌的培养基 两种菌分别在MRS和M17培养基上过夜培养，以它们作为接种体在25°C下培养72小时后每毫升戊糖乳酸杆菌LPS26长出了2×107个菌落，乳酸乳球菌乳酸亚种IPLA947则长出了7.5×106个 9 统计学分析 数据依靠电脑软件进行了差异分析和最小 差异意义监测分析验证（P0.01） 图1.高压液相色谱分析L. pentosus LPS26产生的EPS 分析显示存在分别对应两个峰的两种多聚物，一种大分子量（high-Mw）多聚物（EPS A），分子量1.9×106 Da，另一种小