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SYBR Green I 工作原理 未结合的SYBR green I 第63页/共82页 SYBR Green I 工作原理 第64页/共82页 SYBR Green I的特点 可以用于不同的模板 使用方便，价格相对便宜 灵敏度很高 与非特异性产物结合 融解曲线 选择良好的引物和探针并优化反应条件 第65页/共82页 第66页/共82页 TaqMan Probes 荧光素 淬灭剂 与目标序列互补 FAM TET JOE HEX TAMRA TaqMan 探针的机理 DNA聚合酶在延伸阶段将探针切碎，使荧光基团和荧光淬灭基团分开，于是荧光得以检测 第67页/共82页 第68页/共82页 第69页/共82页 第70页/共82页 TaqMan Probes工作原理 光 能量转移 Taq 游离的探针 荧光基团 淬灭剂 延伸时，Taq酶水解探针，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成荧光信号 Taq 发出荧光 光 另一波长的荧光 第71页/共82页 分子信标(发夹型杂交探针) 荧光基团 茎由互补配对的序列组成 环与目标序列互补 淬灭剂 茎(5-7bp) 环（15-30bp） FAM Texas Red 第72页/共82页 分 子 信 标 工 作 原 理 探针与DNA模板杂交 光 发出荧光 荧光基团 DNA 模板 淬灭剂 茎 环 光 第73页/共82页 Ct与初始模板的关系 固定循环数后，荧光信号与模板数成正比 固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比 初始DNA量越多, 荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少 起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量 Threshold 104 103 102 第74页/共82页 定量PCR 相对定量 提供一种在不需要知道目的基因具体量时,一 种有效的比较样本间 RNA 或 DNA水平的方法 大多数情况下是比较处理组与未处理组，或者 正常组织与病变细胞或组织的mRNA水平的差别 对于多数基因表达研究来说，对某一样本中目 的基因进行绝对定量并不是必须；与参考样本 相比基因表达的上调或下调的水平已是足够的 参考样本被设为Calibrator 第75页/共82页 * 例： 一肿瘤患者手术时 正常组织 淋巴结 肿瘤组织 观察某一基因的表达情况？ 采用SYBR Green I的相对定量 第76页/共82页 * 目的基因 管家基因 第77页/共82页 * 正常组织 淋巴结 肿瘤组织 第78页/共82页 实时定量 PCR 对核酸扩增反应进行直接和动态的监测，实现对靶基因的实时定量分析 例：Taqman探针定量检测沙门氏菌 第79页/共82页 相关系数为0.992 第80页/共82页 Well Assay Well Type Threshold (dR) Ct (dR) Quantity (copies) RSq (dR) A1 FAM Standard 2411.248 26.05 1.00E+03 0.992 A2 FAM Unknown 2411.248 15.74 9.22E+06 0.992 A3 FAM Unknown 2411.248 12.41 1.84E+08 0.992 B1 FAM Standard 2411.248 23.08 1.00E+04 0.992 B2 FAM Unknown 2411.248 16.34 5.37E+06 0.992 B3 FAM Unknown 2411.248 12.36 1.91E+08 0.992 C1 FAM Standard 2411.248 20.92 1.00E+05 0.992 C2 FAM Unknown 2411.248 16.16 6.33E+06 0.992 C3 FAM Unknown 2411.248 10.91 7.02E+08 0.992 第81页/共82页 第82页/共82页 * * 转录后基因沉默（Transcriptional gene silencing ,PTGS）的发现 基因沉默（gene silencing）现象最早是在1990年Napoli等在研究转查尔酮合成酶（chalcone synthase,CHS）基因chs的矮牵牛植株中发现的，他们将与色素全盛有关的chs基因转入矮牵牛，结果原来开开紫花的矮牵牛花的矮牵牛非但花色没有加深反而出现了白花，说明导入的chs基因与同源的内源chs基因的表达均受到抑制。 1990年美国人纳波里利用转基因技术将一种催生红色素的CHS基因插入牵牛花中，期望得到更艳丽的花朵。但意想不到的事情发生了：牵牛花完