九原生质体培养与体细胞杂交.pptVIP

第31页/共38页 看护培养 第32页/共38页 原生质体的生长、分裂 在适宜的培养条件下，原生质体数小时后开始形成新的细胞壁。这时，在显微镜下可见原生质体由圆球形逐渐变为方形、多边形等。约24-36h后，原生质体开始发生第一次分裂；以后随着细胞分裂，原生质体就形成细胞团。 但是，在细胞分裂开始以后，培养基中的甘露醇或山梨醇的浓度要逐渐降低，否则会影响细胞的继续生长、分裂。待原生质体形成的细胞团（愈伤组织）达到1mm时，应将细胞团转移到新鲜的培养基上继续培养。所形成的愈伤组织就可以按照普通的愈伤组织进行培养和植株再生。 第33页/共38页 影响原生质体培养效果的因素 原生质体培养效果的好坏，也可以用植板率来衡量。 植物材料：用于分离原生质体的植物材料对原生质体后来培养的效果影响极大。不同的植物、同一植物不同的品种，其遗传组成存在差异，原生质体的培养效果也就必然有差异。如Yamada曾用26个水稻品种的种子诱导出愈伤组织，再建立悬浮细胞培养，以悬浮细胞分离原生质体，结果只有1个品种的原生质体再生了植株。一般来说，容易培养的植物、外植体，其原生质体也容易培养，反之，亦然。草本比木本容易，幼嫩的材料比成熟的材料容易。 第34页/共38页 培养基 基本培养基 不同植物原生质体要求有不同的基本培养基。使用什么基本培养基，可以参照相应培养愈伤组织或细胞的培养基。一般认为，原生质体培养基种的大量元素应比愈伤组织培养基中的大量元素浓度低。由于Ca2+影响到膜的稳定性，因此较高Ca2+浓度的对原生质体分裂有利。 第35页/共38页 培养基 有机成分：同培养细胞、愈伤组织相比，培养原生质体时要求培养基有更丰富的有机成分，如氨基酸、维生素、CW，YE，LH，CH、小牛血清等。大量的结果表明，培养基中添加谷氨酰胺有利于原生质体的分裂。 激素：培养基中要加入一定浓度的细胞分裂素和生长素。由于2,4-D 促进细胞分裂能力很强，所以培养基中大都要加2,4-D。 条件化培养基：使用条件化培养基可以大大促进原生质体的分裂和细胞团的形成。 第36页/共38页 培养基 培养基中的渗透压：原生质体无细胞壁，所以培养基中必须使用渗透压调节剂（甘露醇、山梨醇等），以维持原生质体的稳定。但渗透压调节剂浓度较高往往会抑制细胞分裂和后来的细胞生长。因此，培养基中渗透压调节剂的浓度不能太高，并且在后来的培养过程中要逐渐降低甘露醇或山梨醇的浓度，以利于细胞的持续分裂和生长。 第37页/共38页 体细胞杂交 原生质体由于没有细胞壁的限制，所以2个原生质体可以彼此靠近，通过膜的融合而融为一体。如果2个相同的原生质体发生融合，则可以实现染色体加倍；如果2个原生质体不同，则就可以实现将2种不同植物的遗传物质组合在一起，形成一个新的杂种细胞，此杂种细胞通过植株再生，则可以得到杂种植株。2个不同体细胞发生融合的过程，称为体细胞杂交。所得到的融合细胞为杂种细胞，再通过植株再生就可以创造出新的植物个体。 第38页/共38页 湖北生态工程职业技术学院生物工程系 * 湖北生态工程职业技术学院生物工程系 * 原生质体的获得 原生质体的概念 原生质体的用途 原生质体的分离 第1页/共38页 原生质体的概念 指植物细胞除去细胞壁以外的部分 第2页/共38页 原生质体的用途 植物原生质体是没有细胞壁的裸露细胞，它在一些研究方面具有独特的优势。 原生质体是研究细胞骨架、细胞壁的形成与功能、细胞膜的结构、大分子物质进出细胞的过程与机理等问题的良好实验体系。 遗传转化：原生质体与外源DNA共培养时，原生质体可以直接吸收外源DNA，并整合到染色体上，从而实现对植物细胞的遗传转化。通过植株再生就可以得到转基因植物。 第3页/共38页 原生质体的用途 体细胞杂交 由于原生质体没有细胞壁，所以不同的原生质体可以相互靠近，发生融合，进行细胞杂交。2个不同植物体细胞发生融合、形成新细胞的过程，称为体细胞杂交。所得到的融合细胞为杂种细胞，再通过植株再生就可能创造出新的植物个体。 第4页/共38页 原生质体的分离 ——机械法 高产量、高质量的分离原生质体是进行原生质体培养和操作的前提。 方法：机械法、酶解法 机械法：通过对植物组织进行切割、研磨等方法破坏植物细胞壁，使原生质体游离出来的一种方法 缺点:效率极低、原生质体破碎严重，完好的原生质体数量少 优点：对原生质体以后的负面影响小 第5页/共38页 原生质体的分离 ——机械法 具体方法：Klercker（1982），大植物细胞置于高渗的蔗糖溶液中，使细胞质壁发生分离，原生质体收缩成球形，然后用利刃切割，在切割的过程中，