六基因操作工具酶.pptVIP

显著特点：热稳定性 70℃ 反应 2 h残留活性为原来的90%； 93℃ 反应 2 h残留活性为原来的60% ；94℃ 反应 2 h残留活性为原来的40%。 应用： （1）DNA序列测定 （2）PCR (polymerase chain reaction)对DNA的特定片段进行体外扩增。 3.3 Taq DNA聚合酶 第31页/共50页 逆转录酶 (reverse transcriptase)： 又称为RNA指导的DNA聚合酶。 活性： 5`→3`聚合酶活性和RNaseH活性。聚合作用所需模板可以是RNA或DNA，引物是带3`-OH的RNA或DNA。 3.4 逆转录酶 第32页/共50页 逆转录酶的活性 第33页/共50页 用途： （1）在体外以mRNA为模板合成cDNA； （2）对有5`突出末端的DNA片段作末端标记（补平）； （3）双脱氧法测序； （4）以DNA或RNA为模板合成核酸探针。 第34页/共50页 活性： 5`→3`聚合酶活性和3`→5`外切酶活性，且3`→5`外切酶活性对单链DNA的作用比对双链DNA强。 高浓度dNTP 环竟下前者活性更强。 应用：标记DNA平末端或隐蔽3`末端 注意：3`外切酶活性无序列特异性 3.5 T4 DNA聚合酶 第35页/共50页 活性：5`→3`聚合酶活性；有单链及双链的3`→5`外切酶活性，但无5`→3`外切酶活性； 特点：极佳的连续合成能力 应用： （1）用于长模板DNA的引物延伸反应； （2）通过单纯的延伸或取代合成途径标记DNA 3`末端； （3）使双链DNA的5`或3`突出末端变成平末端。 3.6 T7 DNA聚合酶 Home 第36页/共50页 4 修饰酶 4.1 碱性磷酸酶 4.2 末端转移酶 4.3 T4多核苷酸激酶 4.4 S1核酸酶 Home 第37页/共50页 4.1 碱性磷酸酶 功能： 催化核酸脱5`-磷酸基团，使DNA或RNA片段5`-P末端转换成5`-OH末端。 来源： 有两种，分别来自于大肠杆菌和小牛肠道，前者叫bacterial alkaline phosphatase (BAP); 后者叫calf intestinal alkaline phosphatase (CIP)。 第38页/共50页 碱性磷酸酶的活性 第39页/共50页 注意： CIP的比活性比BAP的高出10-20倍，CIP在SDS中68℃就可完全失活，而BAP却是热抗性酶。 第40页/共50页 末端转移酶(terminal transferase): 是末端脱氧核苷酸转移酶简称。来源于前淋巴细胞和分化早期的类淋巴细胞。 功能： 催化5`脱氧核苷三磷酸进行5`→3`方向的聚合作用, 逐个将dNTP分子加到线性DNA分子3`-OH端。 4.2 末端转移酶 第41页/共50页 末端转移酶的催化作用 第42页/共50页 用途： (1) 主要用于给外源DNA片段和及载体分子加上互补同聚物尾巴； (2) 标记DNA片段的3`末端。 第43页/共50页 4.3 T4多核苷酸激酶 来源：T4 polynucleotide kinase来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞。 功能：催化γ-磷酸从ATP分子转移给DNA或RNA的5`-OH末端（图）。 第44页/共50页 T4 多核苷酸激酶的活性（正向反应） 第45页/共50页 DNA/RNA（单链或双链） T4多核苷酸激酶的交换活性 第46页/共50页 用途： （1）标记DNA的5`-末端； （2）使缺失5`-P末端的DNA发生磷酸化作用。 第47页/共50页 4.4 S1核酸酶 来源：来源于稻谷曲霉（Aspergillus oryzae） 功能： 是一种高度单链特异的核酸内切酶。 注意： 对双链DNA、双链RNA和DNA-RNA杂交体相对不敏感。 第48页/共50页 S1核酸酶的活性 第49页/共50页 用途： (1)测定真核基因中间隔子序列位置； (2)去除DNA片段中突出的单链尾巴； (3)打开cDNA合成时形成的发夹环结构。 第50页/共50页 第一节 基因操作工具酶 第1页/共50页 酶 酶 限制性核酸内切酶 逆转录酶 DNA连接酶 末端转移酶 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ S1核酸酶 Klenow酶 DNA酶Ⅰ Taq DNA 聚合酶 RNA酶A 多核苷酸激酶 碱性磷酸酶 基因工程操作中最常用的工具酶 第2页/共50页 主要内容 1 限制性核酸内切酶 2 DNA连接酶 3 DNA聚合酶 4 修饰酶 第3页/共50页 酶 主要用途 限制性核酸内切酶 识别DNA特定序列，切割DNA分子 DNA连接酶 连接两个DNA分子或片段