蛋白质化学蛋白质共价结构.pptVIP

三、蛋白质一级结构的测定 （一）蛋白质一级结构的定义 （二）N末端分析 （三） C末端分析 （四）二硫键的拆开和肽链的分离 （五）肽链的完全水解和氨基酸组成的测定 （六）肽链的部分水解和肽段的分离 （七）多肽链中氨基酸顺序的测定 （八）二硫键位置的确定 第32页/共56页 （一）蛋白质一级结构的定义 蛋白质的一级结构是指肽链的氨基酸组成及其排列顺序和二硫键的位置。 氨基酸序列是蛋白质分子结构的基础，它决定蛋白质的高级结构。一级结构可用氨基酸的三字母符号或单字母符号表示，从N-末端向C-末端书写。采用三字母符号时，氨基酸之间用连字符“－”隔开。 第33页/共56页 （二）测定步骤 测定蛋白质的一级结构，要求样品必须是均一的（纯度大于97％）而且是已知分子量的蛋白质。一般的测定步骤是： 通过末端分析确定蛋白质分子由几条肽链构成 将每条肽链分开，并分离提纯。 肽链的一部分样品进行完全水解，测定其氨基酸组成和比例。 肽链的另一部分样品进行N末端和C末端的鉴定。 拆开肽链内部的二硫键。 一部分肽链用部分水解方法降解成一套大小不等的肽段，并将各个肽段分离出来。测定每个肽段的氨基酸顺序。 另一部分肽链样品再用另一种部分水解方法水解成另一套肽段，其断裂点与第一种方法不同。分离肽段并测序。比较两套肽段的氨基酸顺序，根据其重叠部分拼凑出整个肽链的氨基酸顺序。 测定原来的多肽链中二硫键和酰胺基的位置。 第34页/共56页 1、N末端分析 （1）蛋白质的末端氨基与2,4-二硝基氟苯(DNFB) （Sanger试剂）在弱碱性溶液中作用生成二硝基苯基蛋白质（DNP-蛋白质），产物黄色，可经受酸性100℃高温。水解时，肽链断开，DNP-氨基酸能溶于有机溶剂（如乙醚）中，这样可与其他氨基酸和ε-DNP赖氨酸分开。 经双向滤纸层析或柱层析，可以鉴定黄色的DNP氨基酸。 第35页/共56页 1、N末端分析 （2）蛋白质的末端氨基与丹磺酰氯(DNS-Cl)反应，生成DNS-蛋白质。DNS-氨基酸有强荧光，激发波长在360nm左右，比DNFB法灵敏100倍。 肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。 第36页/共56页 1、N末端分析 （3）末端氨基与异硫氰酸苯酯（PITC）在弱碱性条件下形成相应的苯氨基硫甲酰衍生物，后者在硝基甲烷中与酸作用发生环化，生成相应的苯乙内酰硫脲衍生物而从肽链上掉下来。产物可用气-液色谱法进行鉴定。 Edman法 此法是目前应用最广泛方法。 优点是剩下的肽链仍是完整的，可依照此法重复测定新生的N末端氨基酸。现在已经有全自动的氨基酸顺序分析仪，可测定含20个以上氨基酸的肽段的氨基酸顺序。 缺点是不如丹磺酰氯灵敏，可与之结合使用。 （4）N末端氨基酸也可用酶学方法即氨肽酶法测定。 第37页/共56页 N-末端分析 常见问题及处理方法： 经常碰到N-末端残基的氨基被封闭。因此不能与Edman降解试剂发生作用。 焦谷氨酰化、乙酰化以及某些环状肽。 第38页/共56页 2、 C末端分析 （1）C末端氨基酸可用硼氢化锂还原生成相应的α氨基醇。肽链水解后，再用层析法鉴定。有断裂干扰。 （2）多肽与肼在无水条件下加热，可以断裂所有的肽键，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。肼解下来的C末端氨基酸可用纸层析鉴定。精氨酸会变成鸟氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。 （3）羧肽酶法 将蛋白质在pH 8.0, 30℃与羧肽酶一起保温，按一定时间间隔取样，用纸层析测定释放出来的氨基酸，根据氨基酸的量与时间的关系，就可以知道C末端氨基酸的排列顺序。羧肽酶A水解除精氨酸、赖氨酸和脯氨酸外所有肽键，羧肽酶B水解精氨酸和赖氨酸。 第39页/共56页 3、二硫键的拆开和肽链的分离 肽链之间不是共价交联的，可用酸、碱、高浓度的盐或其他变性剂处理蛋白质，把肽链分开。 如果肽链之间以二硫键交联，或肽链中含有链内二硫键，则必须用氧化或还原的方法将二硫键拆开。 最普遍的方法是用过量的巯基乙醇处理，然后用碘乙酸保护生成的半胱氨酸的巯基，防止重新氧化。 二硫键拆开后形成的肽链，可用纸层析、离子交换柱层析、电泳等方法进行分离。 第40页/共56页 4、肽链的完全水解和氨基酸组成的测定 在测定氨基酸顺序之前，需要知道多肽链的氨基酸组成和比例。一般用酸水解，得到氨