荧光分光度法.pptxVIP

§ 2- 1概述重点是荧光光谱分析法生物分子分析的需要促进了它的发展荧光分析法非常灵敏荧光测量在人类基因测序中起了重要作用一、历史二、基本概念三、荧光光谱分析法的特点§ 2- 1概述一、历史：16世纪已经发现荧光，但没有人能解释该现象；1575年西班牙内科医生、植物学家第一次记录荧光现象；1852年斯托克斯观察奎宁、叶绿素荧光，解释了荧光是由于物质吸收了光能后发射出来的分子荧光。1864年，他建立了荧光分析手段。1965年以后，荧光光谱兴趣激增，生物化学家利用它的高灵敏度；20世纪，人类基因组计划的完成，荧光检测技术功不可灭，如今，在生命科学研究中将发挥更大作用。M+热量M+能量M*M+hυ’+热量荧光F磷光P寿命 10-8~10-14s10-4~10s§ 2- 1概述分子选择性吸收能量，电子由基态进入激发态，当电子由激发态返回基态时发射光谱光子——光致发光M+hυ→M*阴极射线——阴极射线发光X射线——X射线发光热——白炽发光超声波——声纳发光离子流——离子发光化学反应能——化学发光§ 2- 1概述二、基本概念荧光是物质分子吸收了较短波长的光（通常是紫外-可见光），在很短的时间内（几纳秒至几微秒）发射出较照射光波长为长的光。荧光光谱分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。激发激发光 物 质强发射荧光强三、荧光光谱分析法的特点1. 灵敏度高荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强度，可提高荧光强度）。 采用高灵敏度的检测系统可大大提高灵敏度，荧光分析法的检测限比分光光度法低2~4个数量级荧光10-7-10-9紫外10-4-10-7 mg/mL三、荧光光谱分析法的特点2. 选择性好不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发光波长不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光波长比较容易排除其它物质的干扰，选择性好3. 实验方法简单4. 待测样品用量少5. 仪器价格适中§ 2- 2荧光光谱法一、荧光光谱基本原理二、荧光分析仪器三、激发光谱与发射光谱四、溶液荧光光谱的特征五、荧光物质的必要条件六、影响物质发光的因素七、定量分析方法八、荧光分析法的应用一、荧光光谱基本原理具有不饱和基团的基态分子光照后，价电子跃迁 基态分子 价电子跃迁到激发态光照激发去激发光 ?* ? ??* ?n基 态 在光致激发和去激发光的过程中，分子中的价电子（ ?、n电子）处于不同的自旋状态，通常用电子自旋状态的多重性来描述能量 A B C（一） 电子自旋状态的多重性荧光 涉及吸收和发射两个过程在同一轨道上成对电子相反方向自旋更稳定分立轨道上非成对电子平行自旋更稳定第一激发单重态 S*1基态单重态 S0（一） 电子自旋状态的多重性大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道中两个电子自旋方向总是相反的?? ，处于基态单重态。用 “S0” 表示 ；当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋 = 0 。S0, S*1, S*2, S*3分别代表基态, 第一, 二, 三激发单重态激发态的平均寿命约为10-8S第一激发三重态 T*1基态单重态 S0若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，由基态单重态→激发三重态，净自旋 ? 0。这种跃迁为禁阻跃迁 T*1、T*2、T*3分别表示第一、二、三激发三重态 自旋平行激发态的平均寿命约为10-4~10S（二）荧光、磷光的产生的机制当处于基态单线态（S0）的分子吸收波长为λ1和λ2的辐射后,分别被激发到第一激发单线态（S1*）和第二激发单线态(S2*)的任意振动能级上,而后发生以下过程： 分子内的激发和去激化过程振动弛豫VR :处于激发态的分子，其电子跃迁到第一激发态（S*1）或更高激发态的不同振动轨道上，分子可以从这些能态以非辐射形式放出能量而到达同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动驰豫，时间约为10-12s数量级。分子内的激发和去激化过程内部转换ic : 当两个电子能级非常靠近以致其振动能级有重叠时，如第一激发单线态的较高振动能级与第二激发单线态S*2的某一较低振动能级的位能相同，可发生电子由高能级以无辐射跃迁的方式跃迁至低能级上。此过程效率高，速度快，一般只需10-13-10-11s。 分子内的激发和去激化过程荧光发射:处于激发单线态的最低振动能级S*1的分子，也存在几种可能的去激化过程。若以10-9-10-7s左右的时间发射光量子回到基态S0的各振动能级，这时分子发射的光量子即称为荧光。分子内的激发和去激化过程外部转化ex :部分激发态分子在分子间、分