peg化可降解peiet的构建 筛选及smad3基因输送研究-construction and screening of peg - degradable pei et and study on smad 3 gene delivery.docxVIP

PEG 化 可 降解 PEI-Et 的构建、筛选及 Smad3 基因输送研究 摘 要动脉粥样硬化有关的疾病是导致死亡最主要的原因，其血管存在不 同程度的损伤。研究发现血管损伤后，血管平滑肌细胞由静止的、分化 状态转变为增殖状态。血管平滑肌细胞增殖的分子机制还不清楚，其中 之一与 Smad3 基因有关。血管损伤后转化生长因子（TGF-β）的表达水 平上调，TGF-β 通过 Smad3 信号通路促进血管平滑肌细胞增殖。 将 Smad3 基因安全有效的转入血管平滑肌细胞，基因载体是关键。 在各类基因载体中，聚阳离子非病毒载体具有安全、基因担载大、化学 结构可控、易于化学修饰等优点。本实验将 PEI 800 Da 作为基本结构单 元，以亚乙基二氯甲酸酯作为交联剂合成阳离子聚合物-PEI-Et，并对其 进行聚乙二醇（PEG）修饰，以屏蔽 PEI-Et 表面过量的正电荷，使其在 保有较高转染活性的基础上，降低载体的细胞毒性。 本论文第一部分研究内容是将 PEI-Et 与 PEG 以不同的摩尔比例（1:1、 2:1、1:2）合成三种不同的 PEG-Et 阳离子聚合物，并研究其与基因缩合 形成的复合物的特征、细胞毒性、转染效率，以筛选出最佳基因输送载体即 PEG-Et 1:1。第二部分研究内容是将 PEG-Et 1:1 作为载体运载shSmad3、Smad3 基因进入兔主动脉平滑肌细胞，运用 PCR、Western blot检测细胞内 Smad3 基因的表达，CCK8 实验检测细胞的增殖。 本论文中，我们成功合成 PEG-Et 1:1，证明其具有缩合基因的能力、细胞毒性低、转染效率高。抑制血管平滑肌细胞内 Smad3 基因的表达， 可抑制血管平滑肌细胞的增殖。为进一步研究体内输送 Smad3 基因奠定 了一定的基础。 关键词：非病毒载体，PEG-Et，兔主动脉平滑肌细胞，Smad3 基因，细 胞毒性，转染效率 CONSTRUCTION, SCREENING OF BIOD--EGRADABLE PEGYLATED PEI-ET AND SMAD3 GENE DELIVERYABSTRACTAtherosclertic-associated diseases are the leading cause of death. There are varying degrees of vascular injury. In response to injury, vascular smooth muscle cells (VSMCs) transform from a quiescent, differentiated state to a proliferative and synthetic phenotype. The molecular mechanisms that trigger VSMC proliferation after vascular injury remain unclear, one of that is Smad3 gene. Transforming growth factor-β (TGF-β) is upregulated at sites of vascular injury. TGF-β, through Smad3 signaling, stimulates VSMC proliferation.Smad3 gene is able to transport into the VSMCs effectively and safely, gene delivery system is the key. Among many gene carriers, cationicpolymers have been developed as safer strategies for gene delivery owing toseveral advantages, including safety, the ease of chemical modification, the ability to transfer large DNA molecules. In this study, we designed and synthesized a novel cross-linked PEI derivative PEI-Et with ethylene biscarbamate linkage, and further modification of PEI-Et with polyethylene glycol in order to shield an excess of pos