pc1基因表达细胞模型的建立及其与肿瘤相关性研究-establishment of pc1 gene expression cell model and its correlation with tumor.docxVIP

英文缩写一览表英文缩写一览表缩写〈英文全文〉PCa (prostate cancer)DEPC(Diethyl pyracanbonat)中文全称前列腺癌焦碳酸二乙酶ED丁A (Efhylenediamine tetra acetic acid)乙二肢囚乙酸PCR (Polymerase chain reaction) RT (Reverse transcription)SDS (Sodium dodecyl sulfate) DMSO (Dimethyl sulfoxide) BSA (Bovine serum albumin) G418 (Geneticin)FCM (Flow cytometry)PSA (Prostate specific antigen) Taqσhennos aquatics)bp (base pair )聚合酶链反应反转录 十二炕基硫酸纳 二甲基亚枫 牛血清白蛋白 遗传霉素流式结黯术 前列腺特异性抗原71生槽热菌碱基对cDNA (complementary deoxyribonucleic acid)互补 DNANBT(Nitro-bluetetrazoliurn)硝基囚氮略蓝BCIP(5-Bromo-4-chtoro- 3嗣indolyl Phosphatξ)5-澳4唰氯-3-P引睐磷酸盐 TEMED(N，N，N N -tetra methyl ethy-Iene diamine)N，N，N N -四甲基乙二胶PAGE (Polyacrylamide gel electrophoresis)聚丙稀酷肢凝胶电泳PC-1基因表达细胞模型的建立及其与辨瘦相关性研究摘要吕的:PC-J 基因是在营转移和雄激素非依磁性的前 列腺癌细胞中异常高表达的新基因。本研究拟建立稳定表 达外源 PC..l 基割的小鼠成纤维绍施株 F 为进一步研究 PC...} 基因的生物学功能提供实验材料。在此基础上通过体内、体外实验，观察 PC-l 蔡嚣的表达对 NIH3丁3 绍胞生物学特性的影响，探讨它与细胞转化、肿瘤形成的关系，为进一步磷究 PC-l 基因与前列腺癌的发生发展关系提供 实验依据和理论基础。方法:1.采用巢式 PCR 技术从原始克隆质粒 pZHR3中扩增出ey编码蛋白分子的 PC-l cDNA 片段，将其克隆 入真核表达载体 pcDNA3.1 (...)/myc-his 。在脂质体介导下， 转染入小鼠成纤维细胞 NIH3T3t 经 G418 筛选获得阳性单克隆。细胞经扩大培养后，进行 PCR 、RT...PCR 和 Westem blot分析，分别检测外源 PC-l 基应在靶细胞的整合情况 及转录、翻译水平的表达。 2. 在第一部分实验基础上， 我们首先通过光镜双察 PC-l 基因转染前后 NIH3T3绍跑 形态学的改变。以 MTT 实验检测细胞生长曲线，问时用 流式短跑仪分析细胞周期，对比观察细胞增殖能力的变化。再通过软琼脂克隆形成试验，判断转染细胞非锚定依 赖性生长的能力。最后以裸鼠致瘤实验，分析新基因 PC-l 对细胞成瘤性的影响。2结果: 1.稳定表达外源 PC-l 基因小鼠成纤维细胞株的建立原始克隆质粒 pZHR3经两次 PCR 后安扩增出 693bp 大小的特异性片段〈包括保护性碱基、酶切位点和 CCACC 序列在内 λ 与理论扩增片段长度相符 F 成功获得了自的 基因 PC-lcDNA 片段。将其克隆入载体 pcDNA3.1( 寸Imyc幡 his 步构建成重级真核表达载体 pcDNA3.1( -)/myc幡 his蛐pc斗， 经 EcoRI 和 BamHI 双酶切产生 5.5怡和 684bp 两条片段， 片段大小与预期结果相同。序列测定结果表明 PC二 lcDNA 编码区段已经正确克搔入真核表达载体 pcDNA3.1忖/myc-his 中，而且与标签分子的 cDNA 正确融合。 利用黯质体介导法将质粒pcDNA3.1( 今Imyc心is幽pc斗和 pcDNA3. 町-)/myc-his 转染 NIH3T3 绍胞p用含有 0418 的选择性培养基进行筛选，两周左右存活细胞局部形戍克 隆，分别挑取了四个转染有重组质粒pcDNA3.1(今lmyc唰 his-pc斗的单克降和二个转染有空载体pcDNA3.1 (-)/myc 七is 的单克隆，扩大培养。以真核表达载体 pcDNA3 .1(→Imyc峭his 上通用引物 T7引物和 BGH反肉引物进行 PCR ，检满克隆绍跑基 组 DNA中表达载体。转染有 PC..1 基囚的四株细胞萝扩增片 段长度为 910pb;转染空载体的二株细胞，扩增片段长度 为 270bpo该结果与理论值完全一致，证明表达载体pc DNA3.1 (寸i/m